مدل سازی و مهندسی پروتئین آنزیم مالتوژنیک آمیلاز ژئوباسیلوسی جهت بررسی پایداری و فعالیت آن

مالتوژنیک آمیلازها گروهی از آنزیم¬های هیدرولیز کننده سیکلودکسترین¬ها و متعلق به خانواده آلفا-آمیلاز (خانواده 13 گلیکوزیدهیدرولاز) می¬باشند. این آنزیم در محلول به صورت همودایمر با دو جایگاه فعال است. هر جایگاه فعال از همکاری دمین a و c یک زیرواحد با دمین n زیرواحد دیگر تشکیل می¬گردد که توانایی هیدرولیز سوبستراهای مختلف از جمله نشاسته، پلولان و سیکلودکسترین¬ها را دارند. با تشکیل همودایمر، جایگاه فعال عمیق و باریکی تشکیل می شود که سوبستراهای مسطح cd نسبت به سوبستراهای پلی¬مری نشاسته یا پلولان ترجیح داده می¬شود. مالتوژنیک آمیلازها از نظر کاربردی و تحقیقاتی بسیار با اهمیت هستند و اخیرا توجه به استفاده از این آنزیم¬ها در صنعت بخصوص در صنایع نانوایی، شیرینی¬پزی و همچنین پزشکی و نیز طراحی داروها چشمگیر بوده است. تاکنون در مورد دست¬ورزی توالی و ارتباط بین دمین¬های آنزیم مالتوژنیک آمیلاز سویه بومی geobacillus sp.gh6 گزارشی ارائه نشده است. هدف از این تحقیق آن است که با طراحی لینکر اختصاصی در بین دمین¬های آنزیم، تغییری در خصوصیات ساختاری، بیوشیمیایی و بیوفیزیکی این آنزیم بومی داده شود. لینکر مذکور به گونه¬ای بین دمین n و دو دمین دیگر همان زنجیره درج گردید که امکان تشکیل و بازسازی جایگاه فعال توسط یک زنجیره منفرد فراهم گردد.. با استفاده از تکنیک¬های مدل¬سازی و شبیه¬سازی، لینکر اختصاصی مناسب برای اتصال دمین¬های آنزیم انتخاب شد و ژن کدکننده آن تهیه گردید. این ژن درe. coli بیان شد و سپس تخلیص گردید. با وارد کردن این لینکر به توالی آنزیم، دمای بهینه آنزیم از °c 65 به °c 45 تغییر کرد، با این حال آنزیم طراحی¬شده نیز همچون آنزیم طبیعی پس از گذشت یک ساعت در °c 60 ،80% فعالیت خود را حفظ می¬کند. هر دو آنزیم در محدوده وسیعی از ph فعال هستند، اما ph بهینه آنزیم تغییر یافته از 5/5-6 به 5/7-8 ارتقا یافته است. هر دو آنزیم، سیکلودکسترین¬ها را به سوبستراهای پلی¬مری ترجیح می¬دهند و تمایل به -α بیشتر از -β و بیشتر از -cd است. این در حالی است که تمایل آنزیم جهش¬یافته نسبت به آنزیم طبیعی به سوبستراهای پلیمری بسیار افزایش یافته است. آنزیم جهش¬یافته فعالیت آلوستریکی در دمای °c 52 و 7 ph= از خود نشان نمی¬دهد؛ این در حالی است که بین دو زیر واحد آنزیم طبیعی در فرم دایمر فعالیتی با تعاونی مثبت دیده می¬شود. این نتایج و نتایج حاصل از کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی نشان دهنده احتمال تشکیل مونومر فعال از این آنزیم است.