بررسی خصوصیات نور نشری و فعالیت نمیوپسین با استفاده از مهندسی پروتئین

نمیوپسین فتوپروتیئنی متصل شونده به کلسیم است که از نمیوپسیس لیدی استخراج شده و به محض میانکنش با کلنترازین و کلسیم نور آبی ساطع می کند. نشر نور نتیجه واکنش اکسیداسیون درون مولکولی است. مشابه سایر فتوپروتیئن های متصل شونده به کلسیم، نمیوپسین نیز متشکل از آپوفتوپروتئین (با 206 باقیمانده آمینواسیدی)، کلنترازین و اکسیژن مولکولی است. تاکنون بیشترین مطالعات عملکردی و ساختاری روی فتوپروتیئن های کلنترات بویژه اکورین و ابلین صورت گرفته و تحقیقات اندکی روی فتوپروتئین های کتفوفور از جمله نمیوپسین انجام شده است. در این تحقیق به منظور بررسی نقش برخی از آمینواسیدهای کلیدی موجود در حفره اتصال به کلنترازین و نیز باقیمانده های مجاور (باقیمانده های لایه ثانویه) در مکانیسم واکنش و ویژگی های بیولومینسانسی نمیوپسین، جهش هایی با رویکرد جایگزینی باقیمانده های مربوطه توسط رزیدوهای متناظر در فتوپروتئین های بسیار شناخته شده اکورین و ابلین در ساختار فتوپروتیئن طراحی گردید و جهش یافته هایی از نمیوپسین با جایگزینی باقیمانده های arg39 (تنها باقیمانده باردار موجود در حفره اتصال به کروموفور)، met77، trp101 و met151 ایجاد شد. در حالیکه فعالیت بیولومینسانسی جهش یافته های r39e، r39m و m77h به طور کامل از دست رفته بود و در جهش یافته های w101f، w101y و m151y شاهد کاهش بسیار چشمگیر فعالیت و نیز تغییر ویژگی های بیولومینسانسی در مقایسه با فتوپروتئین وحشی بودیم، جهش r39k تنها جایگزینی بود که سبب افزایش بیش از نه برابری فعالیت بیولومینسانسی جهش یافته نسبت به نمیوپسین طیبعی گشت و طول موج حداکثر طیف بیولومینسانسی آن مشابه فرم وحشی بود. فعالیت بسیار بالا در گستره وسیعی از ph و نیز افزایش مدت زمان نورزایی از سایر ویژگی های بهبود یافته این جهش یافته در مقایسه با فتوپروتئین طیبعی بود. ضمن اینکه جهش های w101y و m151y نیز منجر به کاهش سرعت تحلیل نور گشته اند. جهش یافته هایw101f، w101y و r39k در غلظت های بالاتری از کلسیم فعال می شدند که احتمالا کاهش سطح در دسترس بعضی از آمینواسیدهای کوئوردینه کننده کلسیم باعث کاهش حساسیت به کلسیم این جهش یافته ها شده است. این در حالیست که جهش یافته m151y رفتار متفاوتی در اتصال به کلسیم در مقایسه با فتوپروتئین وحشی و سایر جهش یافته ها نشان داد که تغییرات دینامیک لوپ های اتصال به کلسیم ممکن است سبب بروز چنین رفتاری شود. مجموع نتایج حاصل از مطالعات اسپکتروسکوپی و تئوری نشان داد که به استثنای جهش یافته w101y، که ویژگی های ساختاری مشابهی با نمیوپسین طبیعی داشت، تغییرات ساختاری در سایر جهش یافته ها نسبت به فرم وحشی محسوس است. به نظر می رسد که عدم فعالیت در جهش یافته های r39e و r39m و کاهش محسوس فعالیت در جهش یافته های w101f، w101y و m151y دلیلی بر حضور این آمینواسیدها در حفره اتصال یا نقششان در مکانیسم عمل است. به علاوه در مورد باقیمانده موقعیت 39، افزایش بسیار چشمگیر فعالیت جهش یافته r39k و غیرفعال شدن کامل جهش یافته های r39e و r39m بر ضرورت حضور بار مثبت در این جایگاه و مشارکت باقیمانده مربوطه در فرآیند نورزایی اشاره دارد. فقدان فعالیت جهش یافته m77h نیز احتمالا به دلیل اهمیت ساختاری متیونین در پایدارسازی جایگاه اتصال به کروموفور می باشد. به نظر می رسد که از چینش آمینواسیدهای متفاوت در دو خانواده کلنترات و کتنفور ساختارهای مشابهی در حفره اتصال به کلنترازین شکل گرفته است. به همین دلیل جایگزینی این آمینواسیدها با آمینواسیدهای متناظرشان از خانواده دیگر (نظیر بسیاری از جهش های این تحقیق و تحقیقات قبلی) یکپارچگی ساختاری حفره را متأثر کرده که آن نیز منجر به تغییرات ساختاری عمده و یا غیرفعال شدن یا کاهش فعالیت نمیوپسین گردیده است.