اماده سازی وکتورهای نهایی و بررسی انتقال ژن igf-1 به کلروپلاست توتون

فاکتور رشد شبه انسولین انسانی (igf-1) به علت دامنه وسیع اثرات بیولوژیکی و فعالیت های آن روی بافت های متنوع به-عنوان یک عامل درمانی بسیار مناسب در بسیاری از ناهنجاری ها شناخته شده. بنابراین تولید تجاری آن در سطح وسیع از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است. پلاستیدهای تراریخت با مزایای منحصر به فردی از قبیل بیان پروتئین در سطوح بالا و کاهش خطرات زیست محیطی بیراکتورهای مناسبی برای تولید پروتئین های انسانی می باشند. با توجه به سهولت انتقال ژن به پلاستید گیاه توتون و بیوماس بالای این گیاه، در این پژوهش انتقال ژن igf-1 به کلروپلاست توتون در دستور کار قرار گرفت. از آنجا که انتقال موفق و پایدار ژن به پلاستید نیاز به ناقل های اختصاصی کلروپلاست دارد، لذا در یک قسمت از این تحقیق دو ناقل اختصاصی مناسب برای انتقال ژن igf-1 به کلروپلاست گیاه توتون ساخته شد (psr1، psr2). این ناقل ها حاوی ژن گزینش گر aada برای گزینش گیاهان تراریخت می باشند. در ناقل psr2، ژن گزینش گر مابین دو توالی تکراری مستقیم loxp جاسازی شده است که امکان حذف ژن گزینش گر از گیاهان تراریخته را فراهم می کند. در ادامه، انتقال ژن igf-1 با استفاده از ناقل های تولید شده و به روش ریز پرتابی بوسیله تفنگ ژنی مورد بررسی قرار گرفت. نتیجه این آزمایشات باززایی یک گیاه مقاوم به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین با استفاده از ناقل psr1 بود. قطعات برگ گیاه باززا شده برای رسیدن به مرحله هموپلاسمی از طریق باززایی مجدد روی محیط حاوی اسپکتینومایسین انتقال یافتند که این آزمایش باید حداقل 3-4 مرتبه تکرار شود. همچنین جهت رد احتمال ایجاد مقاومت در اثر جهش، قطعات برگ گیاه تراریخت شده روی محیط حاوی استرپتومایسین منتقل شدند که باززایی گیاه در این محیط هرگونه احتمال وقوع جهش را منتفی نمود. حضور فیزیکی ژن در گیاه تراریخت با تکنیک pcr تایید گردید.