شناسایی میکروارگانیسم های عامل شانکر درختان میوه هسته¬دار در تعدادی از مناطق مرکزی کشور

بیماری شانکر باکتریایی یکی از مهمترین بیماری¬های درختان میوه هسته¬دار می¬باشد که سبب ایجاد زخم¬های فرورفته تیره رنگ همراه با تراوش صمغ بر روی شاخه¬ها می شود. از عوامل مهم این بیماری xanthomonas arboricola pv. pruni و pseudomonas syringae pv. syringae هستند. به منظور شناسایی میکروارگانیسم¬های دخیل در شانکر درختان میوه هسته¬دار در برخی از استان های مرکزی ایران، نمونه برداری از باغات آلوده به شانکر در بهار سال 1391 از استان های اصفهان، چهار محال و بختیاری، قم و یزد انجام گردید. ساقه¬های آلوده با آب شسته شد. پس از طی مراحل استریل سازی، قطعات دارای علایم پوست ساقه در آب مقطر استریل در ظرف پتری با تیغ خرد گردید. پس از 30-20 دقیقه نگه¬داری در دمای اتاق، چند لوپ از سوسپانسیون به دست آمده در سطح محیط آگار غذایی حاوی دو درصد سوکروز (nas) مخطط شد. پس از 3-2 روز نگه داری ظروف پتری کشت شده در دمای °c 28-26 تک کلونی¬های کرم متمایل به سفید تا صورتی مخمر مانند رشد کردند. سوسپانسیونی از هفت جدایه نماینده به زیر پوست ساقه¬های جوان هلو تزریق گردید و پس از حدود 10-7 روز علایم بیماری ظاهر شد. جدایه های مایه زنی شده به ساقه ها دوباره از شانکرهای ایجاد شده جدا گردید. بررسی های میکروسکوپی و آزمون های فنوتیپی برای شناسایی جدایه ها انجام شد. از الکتروفورز پروتئین های سلولی و روش های سرولوژیکی برای متمایز کردن جدایه ها استفاده شد. شناسایی مولکولی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز صورت گرفت. با استفاده از آغازگر its قطعه مورد نظر تکثیر و توالی یابی شد. توالی های به دست آمده با استفاده از نرم افزار بلاست در ژن بانک (ncbi) با توالی¬های موجود در این پایگاه مقایسه و میزان شباهت تعیین گردید. از ژن 26s و بخشی از ژن های tef، rpb1 و rpb2 نیز برای تأیید شناسایی استفاده شد. تنوع ژنتیکی جدایه¬ها با استفاده از rep-pcr با به کارگیری آغازگرهای eric، box و rep بررسی شد. در بررسی میکروسکوپی جدایه¬ها سلول¬هایی کروی شکل که برخی در حال جوانه زدن بودند مشاهده شد. با مقایسه توالی قطعه its در ژن بانک جدایه¬های مورد نظر بیشترین شباهت را به گونه¬های cryptococcus adeliensis، c. magnus و uzbekistanensis c. نشان دادند. توالی ژن های 26s، rpb1 و rpb2 نیز این شباهت¬ها را تایید کرد. در بررسی سرولوژیکی نیز جدایه¬های شناسایی شده بر اساس توالی، شباهت بالایی با جدایه¬های مرجع همان گونه داشتند. در انگشت نگاری با rep-pcr تنوع بالایی در بین جدایه¬های هر گروه مشاهده شد.