بررسی اثر اسید آمینه های جایگاه اتصال کلسیم بر فعالیت و پایداری آنزیم آلفا آمیلاز- پلولاناز
چکیده
در این تحقیق مطالعاتی برای بررسی و مطالعه اثر اسید آمینه های جایگاه اتصال کلسیم روی پایداری حرارتی آنزیم bmw آمیلاز-پلولاناز انجام شد. سه جهش براساس مقایسه توالی با آمیلاز های مقاوم به حرارت طراحی شد. بر اساس نتایج، جهش h58i افزایش 5/7 برابری در کارایی کاتالیتیک را نشان داد، ضمن اینکه در مورد جهش یافته s76p میزان وابستگی به کلسیم افزایش یافت و در غلظت های بالاتر کلسیم میزان پایداری این آنزیم افزایش یافت. آنزیم حاوی دو جهش فوق، double mutant (s76p/h58i)، با افزایش بیش از 16 برابری کارایی کاتالیتیک مواجه بود ولی میزان پایداری آنزیم کاهش یافت. در ادامه جهش هایی در لوپ اتصال کلسیم (ef-hand like motif) طراحی شد که به منظور اضافه کردن یک واحد dx به لوپ اسید آمینه h58 به asp تبدیل شد که نتایج نشان داد این جهش یافته بدون وابستگی به کلسیم پایدار شده است که به نظر می رسد به دلیل افزایش تمایل برای اتصال به کلسیم و در نتیجه افزایش حضور کلسیم در ساختار آنزیم است. نیمه عمر و کارایی کاتالیتیک این جهش یافته در بافر با غلظت صفر کلسیم به ترتیب 6 و 9 برابر افزایش نشان داد. برای اثبات اینکه فقط asp در آن موقعیت چنین نقشی دارد، h58 به اسید آمینه هایی متفاوت شامل arg، phe و tyr نیز تبدیل شد که نتایج نشان دهنده افزایش فعالیت و پایداری این آنزیم ها با افزایش کلسیم است (مشابه آنزیم وحشی) لذا این آنزیم ها همچنان نسبت به کلسیم وابستگی نشان می دهد. بعلاوه پارامتر های ترمودینامیکی واکنش آمیلولیتیک و واکنش غیرغعال سازی حرارتی، افزایش انرژی فعال سازی فرایند غیرفعال سازی سیستم را برای انواع مقاومتر نشان می دهد. در این مطالعه نشان داده شد که یک جهش نقطه ای می تواند آلفا-آمیلازی مزوفیل را به آنزیمی پایدار تبدیل کند ضمن اینکه همزمان کارایی کاتالیتیک را نیز بهبود بخشد.