مطالعه ی برخی از خصوصیات مولکولی سویه های قابل انتقال با شته ی ویروس تریستزای مرکبات (citrus tristeza virus) در ایران

ویروس تریستزای مرکبات (citrus tristeza virus, ctv) برای اولین بار در سال 1960 با وارد کردن نارنگی انشو (citrus unshiu (macf.) marc.) روی پایه ی پونسیروس(poncirus trifoliata (l.) raf.) از ژاپن به باغ مهدشت ساری واقع در استان مازندران به ایران وارد گردید. پس از سه دهه محدود بودن ویروس به درختان انشوی کانون اولیه، گسترش طبیعی ctv آغاز گردیده و نقش شته ی سبز پنبه (aphis gossypii glov) به عنوان یک ناقل مهم در این مناطق اثبات شد. در این تحقیق، به منظور مطالعه ی گلوگاه ژنتیکی محتمل و تعیین خصوصیت سویه های در حال انتقال ctv، تنوع ژنتیکی ژن پروتئین پوششی جدایه های ctv درختان انشوی آلوده ی کانون اولیه (باغات مهدشت) با جدایه های ctv انتقال یافته با شته از درختان مرکباتی که به طور طبیعی آلوده شده¬اند، با یکدیگر مقایسه گردید. شش جدایه از هر منطقه جمعآوری و تکثیر ژن پروتئین پوششی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با روش rt-pcr انجام شد. الگوی sscp ژن پروتئین پوششی همه ی جدایه¬های انتقال یافته با شته یکسان و از الگوی جدایه های کانون اولیه کاملا متمایز بود. با این حال هر یک از جدایه¬های کانون اولیه دارای الگوی sscp متفاوتی بود که حداقل دارای 6 قطعه بودند که ناهمگنی ژنتیکی میان آن ها را نشان می دهد. متعاقبا، توالی نوکئوتیدی ژن پروتئین پوششی جدایه های b5 و b6 متعلق به باغات مهدشت و توالی نوکئوتیدی ژن پروتئین پوششی جدایه های bf3 و at از بهارستان فجر بررسی گردید. نتایج تنوع ژنتیکی (9/99-92 درصد) را در بین جدایه های کانون اولیه و یکسانی بالای 98 درصد را در بین جدایه های انتقال یافته با شته نشان داد. این نتایج نشان می دهد که یک ژنوتیپ مشخص به وسیله¬ی شته ی سبز پنبه منتقل شده است. به عبارت دیگر، انتقال با شته به عنوان یک گلوگاه ژنتیکی عمل کرده و تنوع را در بین جدایه های ctv کاهش داده است. با مقایسه ی خصوصیات بیولوژیکی و توالی ژن پروتئین پوششی یک جدایه¬ی انتقال یافته با شته به عنوان نماینده با جدایه های دیگر موجود در بانک ژن با منشاء جغرافیائی وخصوصیات بیماریزائی مشخص، این جدایه به عنوان سویه ی زردی گیاهچه اثبات گردید. جهت ردیابی اختصاصی جدایه ی انتقال یافته با شته ی ویروس ctv در شمال ایران، تولید آنتی بادی پلی کلونال مختص سویه ی زردی گیاهچه ضروری است. بیان پروتئین پوششی یک مرحله ی اساسی در تولید آنتی بادی پلی¬کلونال اختصاصی این سویه می باشد. بدین منظور، ژن پروتئین پوششی جدایه ی bf3 بوسیله¬ی آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد و درون ناقل بیانی pet28a همسانه سازی گردید. سلول¬های مستعد e. coli سویه ی bl21 با پلاسمید نوترکیب تراریخت و غربالگری در محیط کشت حاوی آنتی¬بیوتیک کانامایسین و روش colony pcr انجام شد. پس از القای بیان با استفاده از iptg و الکتروفورز پروتئین استخراج شده در ژل sds-page، قطعه ی 25 کیلودالتونی مربوط به پروتئین پوششی cp25 در ژل مشاهده گردید. نتایج حاصل از این پژوهش، نشان دهنده ی تولید غلظت مناسبی از پروتئین نوترکیب در سلول e. coli بود.