همسانه سازی نواحی جناحین ناقل پلاستیدی یونجه

چکیده یونجه ).(medicago sativa l از نظر محتوای پروتئینی، ویتامین و مواد معدنی یک منبع پر ارزش در تغذیه دام محسوب می گردد. بالا بودن عملکرد تر و خشک و قابلیت انباری، این گیاه را برای میزبانی تولید پروتئین های نوترکیب، ترغیب می کند. تراریختی پلاستیدی یونجه نه تنها برای بهبود صفات زراعی بلکه برای تولید انبوه پروتئین های نوترکیب، تولید واکسن های گیاهی و بیوداروها از طریق بوته یا تولید در بیوراکتور های سلول های گیاهی نامزد مطلوبی محسوب می شود. دسترسی به این هدف نیازمند استفاده از ناقل اختصاصی یونجه می باشد. در همین راستا همسانه سازی قطعات ژنوم کلروپلاستی در یک ناقل پلاسمیدی مورد نیاز است. بدین منظور ابتدا نواحی ورود و استقرار ژن های انتقالی در ژنوم یونجه تعیین شده و سپس با استفاده از داده های نوکلئوتیدی مربوط به ژنوم پلاستیدی یونجه و نرم افزارهای مربوطه مثل پرایمربلاست و الیگوآنالیزر به طراحی آغازگرها اقدام شد. برای همسانه سازی قطعه مورد نظر ابتدا dna کل سلولی از روش توسط روش سقای معروف استخراج گردیده و سپس طی واکنش pcr قطعه مورد هدف تکثیر شد. جهت تایید قطعه تکثیر یافته از الکتروفورز ژل آگارز 8/0استفاده بعمل آمد. قطعه مورد نظر با استفاده از کیت استخراج از ژل تخلیص و برای t/acloning از دستور العمل کیت همسانه سازی استفاده شد. برای ترانسفورماسیون باکتریایی ابتدا باکتری های مستعد تولید و سپس محصول واکنش اتصال برای تراریختی آنها مورد استفاده قرار گرفت. پس از تایید حضور قطعه در پلاسمید نوترکیب که به ترتیب به کمک غربالگری سفید- آبی، کلنی pcr و روش آنزیمی انجام گرفته و یک کلنی مثبت نوترکیب انتخاب گردید. پلاسمید استخراج شده از این کلنی جهت توالی یابی قطعه همسانه سازی شده به کشور کره ی جنوبی ارسال گردید. توالی یابی حاصل از آغازگرهای (msif 5-acgagctcaattttcaaa (gtcaacccagt-3) msir 5-acaagcttaaacggtctctccaacgcat-3)) بدست آمد. نتایج توالی یابی با کلیه داده های نوکلئوتیدی موجود در بانک جهانی بلاست شد. بیشترین تشابه به میزان 96 درصد با گیاه یونجه یکسالهtruncatula medicago بدست آمد. این گونه خویشاوند گونه sativa . mمی باشد. بررسی توالی حاصل نشان داد که قطعه ژنی rbcl در این تحقیق همسانه سازی شدند و می توانند در آزمایشات دیگر مورد ارزیابی و استفاده های متنوع قرار گیرند.