علیرغم اینکه همه سلول های یک موجود زنده دارای ژنوم یکسانی هستند، تمایز سلول ها، تشکیل بافتهای مختلف و تداوم عمل آنها نیازمند بیان اختصاصی برخی ژن ها در بافتها و شرایط مختلف است؛ راه اندازهای ژنی یکی از اصلی ترین وظایف را در این مورد برعهده دارند. با توجه به اهمیت ذرت به عنوان یک گیاه زراعی و یک گونه مدل مهم در مطالعات ژنتیکی، جداسازی بخش راه اندازی ژن های آلفا-زئین به عنوان راه اندازهای اختصاصی بذر، در این تحقیق هدف گیری شد. این راه اندازها چه در تولید پروتئین های نوترکیب و چه در تغییر کیفیت و خصوصیات بذر/دانه ذرت می توانند حائز اهمیت باشند. به منظور جداسازی این راه اندازهای اختصاصی ، ابتدا اطلاعات موجود در پایگاه داده های نوکلئوتیدی، جمع آوری شده، سپس اقدام به طراحی آغازگرهای اختصاصی از توالی های مرتبط گردید و از آنها برای تکثیر راه اندازها توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شد. برای تهیه ماده آزمایشی گیاهی، بذور دو رقم 704 و ذرت شیرین در شرایط گلخانه ای کشت شده و با استفاده از روش ctab از گیاهان دو برگی dna کل استخراج شد. پس از ارزیابی محصولات تکثیری و استخراج آنها از ژل، اقدام به همسانه سازی آنها در ناقل pgem-t easy vector گردید. سپس باکتری های سویه dh5? با استفاده از روش tss مستعد شده و با محصول واکنش اتصال تراریخت شدند. برای گزینش کلنی های موردنظر از آمپی سیلین و تست آبی- سفید در حضور x-gal و iptg استفاده شد. حضور قطعه مورد نظر در پلاسمید نیز توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز کلنی ها و برش آنزیمی تأیید شد. پس از توالی یابی، نتایج بدست آمده با اطلاعات موجود در شبکه مقایسه شده و تفاوت ها و شباهت های آنها مشخص گردید.

با توجه به یافته های جدید در زمینه اهمیت روغن در تغذیه انسان و نیز موارد صنعتی کاربرد آن، گیاهان روغنی به عنوان یکی از منابع عمده تامین کننده روغن، مورد توجه محققین قرار گرفته است. سطح زیر کشت کلزا به عنوان یک گیاه روغنی در کشور به ویژه در سال های اخیر در حال گسترش بوده است با توجه به این امر بهبود کیفیت روغن حاصل، از طرق مختلف از جمله دستکاری ژنتیکی گیاه، نیز بایستی مورد توجه قرار بگیرد. تحقیق حاضر در راستای امر فوق، به عنوان گام موثر در بهبود کیفیت روغن کلزا انجام گرفته است. بدین صورت که ابتدا از طریق بانک های اطلاعاتی dna، توالی ژن هایfad2 و fatb درگیر در سنتز اسیدهای چرب در کلزا و گیاهان مشابه مورد بررسی قرار گرفت و برای تکثیر اختصاصی آن ها آغازگرهای مورد نیاز با استفاده از نرم افزار پرایمر- بلاست طراحی و برای سنتز سفارش داده شد. به منظور تکثیر قطعات ژنی از دستگاه ترمال سایکلر استفاده گردید. قطعات تکثیر یافته با روش pcr پس از خالص سازی از ژل آگارز با وکتور pgemt-easy اتصال و بعد از همسانه سازی توسط باکتری e. coli ، توالی یابی گردید و پس از اطمینان از توالی همسانه سازی شده، اقدام به همسانه سازی این قطعات در یک وکتور دوگانه بعنوان سازه rnai گردید و در نهایت پس از تایید قطعات مورد هدف، آگروباکتریوم حاوی سازه rnai با روش ذوب و انجماد تهیه گردید که سازه مذکور شامل رشته سنس و آنتی سنس قطعات fatb و fad2 تحت راه انداز 35s و پایان دهنده nos می باشد ؛ که گام موثری در جهت تولید گیاه کلزا با محتوای اسیداولئیک بالا در تحقیقات آینده محسوب می-گردد

وجود سازه اختصاصی بذر برای تغییر ژنتیکی پروفایل پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت از مهمترین نیازهاست که در این تحقیق هدف گیری شده است. پروتئین های ذخیره ای غالب دانه ذرت، یعنی زئین ها که60% پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت را تشکیل می دهند ، از نظر محتوای اسیدآمینه های ضروری مانند لیزین و تریپتوفان دارای کمبود هستند که این امر منجر به کیفیت غذائی پائین دانه ذرت می شود. از طریق شناسایی موتانت ها یا دستکاری های ژنتیکی انجام شده، نشان داده شده است، دانه هایی که میزان پروتئین های زئین آنها کاهش یافته، میزان کل اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان در آنها افزایش پیدا کرده است. زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین 40% از کل پروتئین های زئین را تشکیل می دهد و تقریبا بصورت کامل از اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان تهی است. هدف از اجرای این تحقیق تولید سازه پلاسمیدی rnai (rna interference) اختصاصی بذر برای خاموشی ژن های مربوط به زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین از طریق فناوری rnai می باشد تا از این طریق موجبات کاهش پروتئین های زئینی فقیر از اسیدآمینه های ضروری و به دنبال آن افزایش پلیوتروپیک پروتئین های غیر زئینی غنی از اسیدآمینه های لیزین فراهم گردد. بمنظور ساخت سازه مورد نظر، رشته همسو و ناهمسو ژن مورد نظر که هر دو تحت تنظیم یک راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر ذرت قرار دارند و توسط یک رشته غیر مشابه جدا می شوند در یک سازه با همدیگر همسانه سازی شدند. برای این کار در ابتدا قطعات مورد نظر شامل قطعه 19pro&s (رشته همسو حاوی راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر) و قطعه 19as (رشته ناهمسو) بوسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و پس از تایید اندازه آنها بوسیله الکتروفورز ژل آگارز، بصورت جداگانه در حامل همسانه سازیpgem-t شرکت promega همسانه-سازی شدند. سپس قطعه 19as که تا پیش از این در حامل یاد شده همسانه سازی شده بود با برش توسط آنزیم های برشی sac i و pst i از حامل خارج و پس از استخراج از ژل آگارز بوسیله کیت استخراج از ژل شرکت bioneer، در حامل همسانه سازی حاوی قطعه 19pro&s تهیه شده از قبل و در پایین دست این قطعه و بصورت ناهمسو با آن درج شد. بعد از رونویسی این توالی تشکیل یک مولکول rna دورشته ای سنجاق سری را می دهد که آغازگر فرایند rnai است. در طول ساخت سازه مورد نظر صحت قطعات با استفاده از توالی یابی تایید شدند. آنالیزهای مقایسه ای کاست ساخته شده با نتایج ثبت شده با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی انجام گرفت.

امروزه تکنولوژی انتقال ژن به یک ابزار بنیادی برای تحقیقات پایه ای در بسیاری از مطالعات گیاهی تبدیل شده است. پایین بودن سطح بیان ژن های انتقالی به گیاهان تراریخته از مهمترین فاکتورهای محدود کننده مهندسی ژنتیک گیاهی است. بنابراین فعالیتهای تنظیمی پروموترها در رونویسی برای بهبود کارائی سیستم تراریخت گیاهی مورد مطالعه قرار می گیرد. به دلیل اهمیت سیب زمینی به عنوان چهارمین غذای مصرفی بعد از گندم، برنج و ذرت این تحقیق روی گیاه مزبور انجام شد. از آنجایی که غده سیب زمینی قسمت خوراکی و مصرفی این گیاه محسوب می شود شناسایی وجداسازی راه انداز اختصاصی آن هدف اصلی این تحقیق می باشد. همچنین از آنجاییکه وجود توالی سیگنال پپتید موجب انتقال پروتئین های نوترکیب به اندام مورد نظر می شود شناسایی و جداسازی این توالی نیز به همراه ناحیه پروموتری هدف گیری شد. در این تحقیق ابتدا اطلاعات مربوط به راه انداز اختصاصی ژن از گیاهان مختلف جمع آوری شده وبا راه اندازهای اختصاصی غده سیب زمینی از نظر توالی نوکلئوتیدی مورد مقایسه قرار گرفت و با استفاده از قسمتهای مشترک و مورد نظر از این راه اندازها آغازگرهایی طراحی شد و برای تولید سفارش داده شدند. برای دسترسی به نواحی مورد نظر پس از استخراجdna از گیاه سیب زمینی، واکنش زنجیره ای پلی مراز با استفاده ازآغازگرهای اختصاصی انجام پذیرفت. بعد از تکثیر قطعات مورد نظر،این قطعات در پلاسمید pgem- t همسانه سازی شدند و باکتری های تراریخت تولید شد و پلاسمیدهای استخراج شده از آنها از طریق آنزیم های برشی مورد تایید قرار گرفتند و نهایتا برای تعیین توالی آنها اقدام شد. توالی های حاصله مجددا مورد بررسی های بیوانفورماتیکی قرار گرفته و نتیجه گیری های لازم یعنی شباهت قطعات همسانه سازی شده با اطلاعات موجود در ncbi تایید شدند.

مهندسی ژنتیک پلاستیدی در جهت تولید فراورده های جدید در کروموپلاست توت فرنگی و بهبود کیفیت محصول، نیازمند ناقل های اختصاصی می باشد. در این فن آوری تراریختی، طراحی و ساخت ناقل اختصاصی به منظور دستکاری ژنوم پلاستیدی و تولید فراوردهای جدید به عنوان اولین گام، مورد توجه محققین واقع می گردد. اختصاصی بودن این ناقل ها به خاطر وجود توالی های مشابه با ژنوم پلاستیدی گیاه مورد هدف بوده که امکان وقوع نوترکیبی همتا بین ژنوم پلاستیدی و ناقل را فراهم می سازد. برای رسیدن به این هدف ابتدا توالیdna پلاستیدی توت فرنگی به منظور تعیین مکان ورود ژن )های( انتقالی مورد مطالعه قرار گرفت و با کمک نرم افزارهایprimer-blast و oligo analyzer طراحی آغازگرهای اختصاصی از ناحیه مورد نظر انجام پذیرفت. بعد از استخراج ژنوم کل از گیاه توت فرنگی، تکثیر قطعه مورد هدف با کمک آغازگرهای اختصاصی طی واکنش زنجیره ای پلی مراز انجام گردید، صحت واکنش از نظر طول قطعه توسط الکتروفورز بررسی شد. بعد از تخلیص باند از ژل آگارز و تعیین مقدار غلظت قطعه dna، مراحل همسانه سازی t/a انجام پذیرفت و عملیات تراریختی باکتریایی به طریق شوک حرارتی دنبال شد. نتیجه تراریختی باکتریایی که به صورت کلنی های سفید در محیط نیمه جامد در حضور آنتی بیوتیک، iptg و x-galدیده می شود از طریق کلنی pcr بررسی گردید. از کلنی های pcr مثبت کشت مایع شبانه باکتریایی انجام و اقدام به استخراج پلاسمید شد. پلاسمید جداسازی شده پس از تایید آنزیمی طول قطعه همسانه سازی شده و مکان های برشی تعبیه شده در آن، جهت توالی یابی به شرکت bioneer ارسال گردید و نتایج حاصل از طریق نرم افزارهای بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت. میزان تشابه نتایج توالی یابی شده با توالی مرجع100% و 99% و تغییرات نوکلئوتیدی در نواحی همسانه سازی شده مربوط به تغییرات جایگزینی بود.

فلفل با نام علمی capsicum annuum l. گیاهی یک ساله متعلق به خانواده سولاناسه ((solanaceae و دارای خواص دارویی بسیار ارزشمند بوده و در درمان بسیاری از بیماریها از جمله بیماریهای قلبی، فشارخون بالا، چاقی دیابت و نیز در افزایش اشتها کاربرد دارد. با توجه به اهمیت انواع پلاست‏ در این گیاه، تولید گیاهان ترانس پلاستومیک فلفل ارزشمند بوده و اجرای این تحقیق به عنوان اولین حلقه‏ی اساسی هدف گیری شده است. مرحله نخست در این تحقیق تعیین نواحی جناحین در ژنوم کلروپلاست بوده که از ناحیه ژنومی کلروپلاست انتخاب شد. آغازگرهای اختصاصی بر اساس توالی نوکلئوتیدی دانلود شده از بانک اطلاعاتی ncbi و به کمک نرم افزار پرایمربلاست طراحی گردیده و قطعه dna پلاستیدیِ هدف گیری شده، بوسیله واکنش زنجیره‏ای ِپلیمراز تکثیر و سپس به کمک تکنیک t/a-cloning همسانه‏سازی شد. در این همسانه‏سازی از سویه dh5? باکتری‏های e.coliو ناقل خطی ptg19-t استفاده گردید. برای آنالیز باکتری‏های تراریخته از کلنی‏ pcr و روش برش آنزیمی به کمک مکان‏های برشی تعبیه شده در آغازگرها استفاده شد. جهت توالی یابی قطعه همسانه‏سازی شده، پلاسمید هایِ نوترکیب استخراج شده به روش کیت به شرکت bioneer کره جنوبی ارسال و نتایج توالی‏یابی صحت همسانه‏سازی را تایید کرد. میزان تشابه نتایج توالی یابی شده با توالی مرجع 99% و تغییرات نوکلئوتیدی در نواحی همسانه سازی شده مربوط به تغییرات جایگزینی و اضافه شدن بود.

rnai به سرعت جایگاه خود را به عنوان یک ابزار مهندسی ژنتیک معکوس جهت خاموشی بیان ژن های هدف در گیاهان به دست آورده است. توانایی هدف گیری اعضای خانواده چندگانه ژنی توسط یک ژن تراریخت القا کننده rnai از جمله ویژگی این روش به شمار می رود. در حالی که جهش های حاصل از حذف و اضافه شدن قابل بازگشت هستند، غالبیت rnai در خاموشی ژن ها یکی دیگر از ویژگی های آن به شمار می رود. فناوری در حال حاضر جهت القای rnai در گیاهان، برگرفته از کشف خاموشی موثر ژن هدف از طریق بیان یک توالی mrna حاوی توالی تکراری معکوس می باشد. گاما گلیادین ها، از جمله مهمترین زیر واحد های گلوتن می باشند که بالغ بر 12 درصد پروتئین های گندم هگزاپلوئید را به خود اختصاص می دهند. در چندین دسته بندی اختصاصی صورت گرفته، مشاهده گردیده است که اغلب مبتلایان به بیماری سلیاک نسبت به پپتید های گاما گلیادین واکنش نشان می دهند. فناوری rnai می تواند به عنوان یک ابزار موثر جهت دستکاری بیان ژن گاما گلیادین و کاهش هسته های اپیتوپی بیماری سلیاک برگرفته از خانواده چندگانه ژنی گاما گلیادین در گندم معمولی و سایر گونه های نزدیک مرتبط با آن مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، شناسایی و همسانه سازی ناحیه تکرارپذیر domain ii مربوط به ژن گاما گلیادین، اولین گام در جهت ساخت ناقل rnai ژن گاما گلیادین می باشد. فلذا، تمام توالی های مربوط به ژن گاما گلیادین توسط نرم افزار blastn شناسایی شده و از پایگاه genbank موجود در ncbi استخراج گردید. dna کل ژنومی توسط روش ctab از برگ های تازه گیاه گندم استخراج شد. آغازگرهای اختصاصی طراحی گردیده و جهت جداسازی نواحی اختصاصی ژن گاما گلیادین مورد استفاده قرار گرفت. قطعه تکثیر شده توسط واکنش pcr در ژل آگارز 8/0 درصد جداسازی شده و توسط کیت تخلیص از ژل، خالص گردید. قطعه تخلیص شده، در داخل ناقل ptg19-t همسانه سازی شده، سپس به سلول های باکتریایی مستعد e.coli سویه dh5? تراریخت گردید. کلنی های تراریخت، توسط سیستم آبی/ سفید غربال شدند. تخلیص کلنی های سفید مثبت، توسط کلنی pcr انجام گردید. پلاسمید های نوترکیب موجود در کلنی های pcr مثبت توسط روش استخراج پلاسمید لیز قلیایی، استخراج شده و پلاسمیدهای نوترکیب با خلوص بالا توسط شرکت bioneer توالی یابی گردیدند. قطعه توالی یابی شده در یک مقایسه گسترده با سایر توالی های گاما گلیادین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و توالی اسید آمینه ای آن جهت تعیین نواحی اپیتوپی شناسایی گردید. آغازگرهای اختصاصی برای قطعه کوچک معکوس طراحی شده و پس از تکثیر قطعه معکوس کوچک، پلاسمید های نوترکیب توسط آنزیم های برشی، برش داده شده و قطعه کوچک معکوس در ناقل پلاسمیدی نوترکیب همسانه سازی گردید. در خاتمه، یک ناقل rnai ژن گاما گلیادین گندم محتوی هسته های اپیتوپ بیماری سلیاک ساخته شد.

چکیده یونجه ).(medicago sativa l از نظر محتوای پروتئینی، ویتامین و مواد معدنی یک منبع پر ارزش در تغذیه دام محسوب می گردد. بالا بودن عملکرد تر و خشک و قابلیت انباری، این گیاه را برای میزبانی تولید پروتئین های نوترکیب، ترغیب می کند. تراریختی پلاستیدی یونجه نه تنها برای بهبود صفات زراعی بلکه برای تولید انبوه پروتئین های نوترکیب، تولید واکسن های گیاهی و بیوداروها از طریق بوته یا تولید در بیوراکتور های سلول های گیاهی نامزد مطلوبی محسوب می شود. دسترسی به این هدف نیازمند استفاده از ناقل اختصاصی یونجه می باشد. در همین راستا همسانه سازی قطعات ژنوم کلروپلاستی در یک ناقل پلاسمیدی مورد نیاز است. بدین منظور ابتدا نواحی ورود و استقرار ژن های انتقالی در ژنوم یونجه تعیین شده و سپس با استفاده از داده های نوکلئوتیدی مربوط به ژنوم پلاستیدی یونجه و نرم افزارهای مربوطه مثل پرایمربلاست و الیگوآنالیزر به طراحی آغازگرها اقدام شد. برای همسانه سازی قطعه مورد نظر ابتدا dna کل سلولی از روش توسط روش سقای معروف استخراج گردیده و سپس طی واکنش pcr قطعه مورد هدف تکثیر شد. جهت تایید قطعه تکثیر یافته از الکتروفورز ژل آگارز 8/0استفاده بعمل آمد. قطعه مورد نظر با استفاده از کیت استخراج از ژل تخلیص و برای t/acloning از دستور العمل کیت همسانه سازی استفاده شد. برای ترانسفورماسیون باکتریایی ابتدا باکتری های مستعد تولید و سپس محصول واکنش اتصال برای تراریختی آنها مورد استفاده قرار گرفت. پس از تایید حضور قطعه در پلاسمید نوترکیب که به ترتیب به کمک غربالگری سفید- آبی، کلنی pcr و روش آنزیمی انجام گرفته و یک کلنی مثبت نوترکیب انتخاب گردید. پلاسمید استخراج شده از این کلنی جهت توالی یابی قطعه همسانه سازی شده به کشور کره ی جنوبی ارسال گردید. توالی یابی حاصل از آغازگرهای (msif 5-acgagctcaattttcaaa (gtcaacccagt-3) msir 5-acaagcttaaacggtctctccaacgcat-3)) بدست آمد. نتایج توالی یابی با کلیه داده های نوکلئوتیدی موجود در بانک جهانی بلاست شد. بیشترین تشابه به میزان 96 درصد با گیاه یونجه یکسالهtruncatula medicago بدست آمد. این گونه خویشاوند گونه sativa . mمی باشد. بررسی توالی حاصل نشان داد که قطعه ژنی rbcl در این تحقیق همسانه سازی شدند و می توانند در آزمایشات دیگر مورد ارزیابی و استفاده های متنوع قرار گیرند.

بیماری سلیاک که به آن آنتروپاتی گلوتن نیز گفته می شود در اثر آسیب مخاط روده ی کوچک در طی مصرف گلوتن ایجاد می شود. افراد مبتلا قادر به تحمل پروتئین گلوتن نیستند . گلوتن شامل دو خانواده گلوتنین و گلیادین ها است . گلیادین ها شامل سه نوع آلفا و گاما و امگا هستند .علم بیو تکنولوژی مدرن قادر است مشکلات ناشی از پروتئین های حساسیت زا را حل و به حداقل برساند. از روشهای موثر پیش رو در این خصوص فناوری rnai است که برای خاموش یا کاهش بیان ژن به کار می رود.هدف از این تحقیق انجام گامی ضروری در جهت کاهش پروتئین گلوتن کندم با استفاده از تصویر قطعات ژنی آلفا گلیادین و طراحی ساختارrnai برای کاهش بیان پروتوین گلوتن گندم می باشد.