کلونینگ، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات آنزیم کلسترول اکسیداز از گونه استرپتومایسس

کلسترول اکسیداز ( cho, ec 1.1.3.6) یک الکل دهیدروژناز/ اکسیداز متعلق به خانواده ی گلوکز -متانول-کولین (gmc) اکسیدوردوکتاز و وابسته به فلاوین آدنین دی نوکلئوتید (fad) است که اکسیداسیون کلسترول (cholest-5-en-3?-ol) را با مصرف اکسیژن مولکولی برای ایجاد cholest-4-en-3-one و پراکسید هیدروژن (h2o2) کاتالیز می کند. با توجه به ویژگی سوبسترایی و فعالیت، کلسترول اکسیداز مشتق شده از سویه های استرپتومایسس در کیت های سنجش کلسترول مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق نیز از یک سویه ی بومی استرپتومایسس استفاده شد. ژن مورد نظر پس از تکثیر، در وکتور بیانی pet28a کلون و در باکتریdh5? e.coli انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت.بیان پروتئین در سویه bl21 e.coli مورد بررسی قرار گرفت، از آنجایی که درصد بالایی از پروتئین به شکل اجسام توده ای بیان می شدند، به منظور افزایش بیان پروتئین به فرم محلول شرایط مختلف دمایی، زمانی و میزان القاکننده iptg در سویه های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان، تخلیص آنزیم، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز انجام و فعالیت آنزیم سنجیده شد.