بسیاری از محیطهای کشت صنعتی دارای اسیدهای آلی به عنوان بخش مهمی از ترکیبات محیط می باشد. حضور مولکولهای اسیدی تغیرات متابولیکی را القا می کند که منجر به تنظیم فعالیتهای میکروبی می گردد. اسیدهای آلی نقش های دیگری در تولید زانتان بازی می کند. برای تولید زانتان با استفاده از محیط سنتزی سیتریک اسید به عنوان عامل شلاته کننده به منظور جلوگیری از رسوب نمکها محیط سنتزی تخمیر در طی استریلیزاسیون گرمایی استفاده شد. نشان داده شده است که اضافه کردن اسید سیتریک به ترکیبات محیط کشت بازده تولید زانتان را افزایش می دهد. محققین نشان داده اند که حدواسطهای چرخه tca باید اثر مشابه با اسید سیتریک بر روی سنتز زانتان داشته باشند. در این بررسی تولید بیوپلیمر زانتان با استفاده از اسیدهای آلی به عنوان منبع کربن توسط xanthomonas campestris b82 بررسی شد که در ابتدا میزان حداقل غلظت مهارکننده رشد برای اسیدهای استیک، سوکسینیک، فوماریک، فورمیک، و سیتریک سنجش گردید. میزان mic بر حسب میلی مولار برای اسید استیک (200)، اسید سوکسینیک (300)، اسید فوماریک(300)، اسید فورمیک(200)، اسید سیتریک (100) می باشد. برای بررسی اثر دقیق تراسیدهای آلی، اسید سیتریک که در تمامی محیطهای کشت صنعتی تولید زانتان به عنوان جزئی از ترکیبات محیط به کار می رفت حذف گردید و تنها یک اسیدآلی به عنوان منبع کربن علاوه بر سوکروز به کار رفت. نتایج به دست آمده با اسید سوکسینیک در غلظت 12/5 میلی مولار (g/l 14/66) بهتر از اسید سیتریک در غلظت 12/5 میلی مولار (g/l 14/3) بود و نتایج حاصل از اسید فوماریک مشابه سیتریک اسید مشاهده شد. نتایج تولید زانتان حاصل از اسید استیک و اسید فورمیک به عنوان منبع کربن اختلاف معناداری با سایر اسیدها در غلظتهای بهینه نشان داده نشد. بررسی تولید زانتان با استفاده از اسید آلی به عنوان محرک تولید نشان داد افزودن غلظتهای پایینی از اسید استیک در ابتدای فاز سکون و یا انتهای فاز لگاریتمی تولید زانتان را افزایش می دهد. افزودن 2 پالس اسید استیک 25/6 میلی مولار در انتهای فاز لگاریتمی (ساعات 24 و 26 پس از شروع کشت لگاریتمی) باعث تراکم زانتان بیشتری ( g/l11/5) نسبت به 3 پالس (g/l 11/05) و 1 پالس اسید (g/l 10/05)می گردد. روش سنجش atp نشان داد که در atp درون سلولی کاهشی ایجاد می شود که به نوبه خود هدایت مسیرهای متابولیک بسوی افزایش تولید زانتان را تشدید می کند.

لیپوزوم های کاتیونی ساختار های دو لایه متشکل از فسفولیپید ها هستند . یکی از مهمترین کاربرد های آن ها، استفاده به عنوان حامل های انتقال دارو و حامیلن انتقال ژن در ژن تراپی است. در مطالعات گذشته از ماده فلورسنت کربوکسی فلورسئین به عنوان نشانگر انتقال دارو استفاده شده است . پدیده بیولومینسانس که حاصل اثر آنزیم لوسیفراز برروی سوبسترای لوسیفرین است و در حضور mg2+ و اکسیژن تولید نور می کند می تواند جایگزینی برای کربوکسی فلورسئین و سیستم فلورسانس باشد . در فاز اول این مطالعه سعی بر این است که با ساخت لیپوزوم و وارد کردن لوسیفرین به درون آن و بررسی آزادسازی لوسیفرین از لیپوزوم ها با استفاده از اثر تخریبی آنتی بیوتیک نیسین (nisin) برروی دیواره لیپوزوم، زمینه استفاده از سیستم بیولومینسانس به عنوان نشانگر جدید انتقال دارو فراهم شود . ساخت لیپوزوم های کاتیونی و وارد کردن لوسیفرین به درون آن به روش fdel انجام شد و موفقیت ورود لوسیفرین با استفاده از سنجش آنزیمی لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. از طرف دیگر ژن آنزیم لوسیفراز یکی از ژن های گزارشگری است که در مطالعات مختلف برای اندازه گیری کارایی انتقال ژن در شرایط in-vivo و in-vitro مورد استفاده قرار می گیرد. در مطالعات گذشته، فورمولاسیون های مختلفی از لیپوزوم ها برای انتقال انواع مختلفی از ژن های گزارشگر مورد استفاده قرار گرفته است. در فاز دوم این پژوهش – برای اولین بار – کارایی دو نوع لیپوزوم کاتیونی با فورمولاسیون جدید جهت انتقال پلاسمید pgl3 – پلاسمیدی که دارای ژن لوسیفراز به عنوان گزارشگر است – به درون سلول های دودمان سلولی cho مورد بررسی قرار گرفت. لیپوزوم های کاتیونی متشکل از نسبت های مولی مختلف از dppc / chol/ doab و dppc/ doab با روش fdel سنتز شد و ترانسفکشن سلول های cho با پلاسمید pgl3 توسط غلظت های مختلفی از لیپوزوم های کاتیونی سنتز شده انجام گرفت. کارایی ترانسفکشن و میزان بیان ژن لوسیفراز بوسیله سنجش آنزیمی لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت کارایی بالای ترانسفکشن با استفاده از این فورمولاسیون های جدید بدست آمد.

بررسی ساختار فضایی و هم ترازی توالی پروتئینی دومین اگزونوکلئازی 3-5 آنزیمهای dna پلیمراز i باکتری ترموفیل geobacillus sp.mkk نشان می دهد که اسیدآمینه های کاتالیتیک جایگاه فعال اگزونوکلئازی 3-5 تغییر کرده و آنزیم این فعالیت خود را از دست داده است. به منظور بازگرداندن این فعالیت به آنزیم با استفاده از روش جهش زائی نقطه ای اسیدآمینه های کلیدی و مهم در جایگاه فعال اگزونوکلئازی 3-5 جایگزین اسیدآمینه های متناظر در آنزیم mkk پلیمراز شد. 7 مولکول جهش یافته از این آنزیم ساخته شد که شامل مولکولهای m1 (v319d, e325l)، m2 (a376d)، m3 (d425f)، m4 (insy446, k450d)، m12 (v319d, e325l, a376d)، m123 (v319d, e325l, a376d, d425f) و m1234 (v319d, e325l, a376d, d425f, insy446, k450d) می باشد. بعلاوه یک مولکول هیبرید به نام mkkec نیز ساخته شد که در آن دومین اگزونوکلئازی 3-5 در آنزیم mkk با دومین مشابه در آنزیم dna پلیمراز i باکتری e.coli جا به جا شده بود. برای اولین بار تمامی اسیدآمینه های ضروری برای فعالیت اگزونوکلئازی 3-5 به یک مولکول جهش یافته وارد شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که از میان تمامی مولکولهای جهش یافته تنها دو مولکول جهش یافته m1234 و mkkec دارای فعالیت اگزونوکلئازی 3-5 هستند. بعلاوه نتایج سنجش فعالیت آنزیمی نشان داد که آنزیم جهش یافته m1234 در مقایسه با آنزیم وحشی mkk پلیمراز فعالیت پلیمرازی خود را نسبتا حفظ کرده در حالیکه مولکول هیبرید mkkec کاهش فعالیت پلیمرازی را نسبت به آنزیم وحشی نشان میدهد.

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب در طی دو مرحله، ابتدا با نقش لیگازی با استفاده از atp و یون منیزیم و سپس با نقش مونو اکسیژنازی به کمک o2، لوسیفرین (سوبسترا) را به ترکیب برانگیخته ای بنام اکسی لوسیفرین تبدیل می کند. اکسی لوسیفرین در هنگام برگشت به حالت پایه تولید نور با بازده کوانتایی بالا می کند. در بین حشرات تنها گونه p.hirtus از railroad worms بطور طبیعی نشر نور قرمز دارد.از ویژگیهای ساختاری آن وجود r353 ، که در سایر لوسیفرازهای با نشر نور سبز موجود نمی باشد. ورود اسید آمینه آرژینین در موقعیت مشابه در گونه ایرانی l.turkestanicus باعث شیفت نور قرمز و پایداری حرارتی شد.برای بررسی بیشتر نقش این موقعیت در رابطه با مکانسیم ایجاد رنگ نور از ورود چهار اسید آمینه (k,r,e,q) با اندازه زنجیره جانبی مشابه ولی با بار متفاوت در گونه p.pyralis استفاده شد. ورود اسید آمینه آرژینین و لیزین باعث شیفت نور قرمز شد.در این پروژه با مطالعه مقایسه ای دناتوراسیون شیمیای پروتئین وحشی وموتانت ها با روشهای فلورسانس ذاتی و خارجی و دورنگ نمایی حلقوی و کالیمتری روبشی تفافضلی نشان می دهد که ورود اسید آمینه آرژینین و لیزین در لوپ انعطاف پذیر (352-358) نقش مهمی در پایداری ساختاری( p.pyralis) دارد. درمطالعات کینتیکی با فلورسانس جریان متوقف، ثابت سرعت بازتاخوردگی و واسرشتگی در پروتئین وحشی و موتانت ها نشان میدهد که میانکنش های مورد نظر در این لوپ، جزء آن دسته از میانکنش هایی هستند که در واکنش فولدینگ پروتئین نقش دارند.

در این پروژه به بررسی پایداری و خواص سینتیکس آنزیم لوسیفراز در حضور حلالهای آلی پرداختیم. از آنجا که آنزیمها در حلالهای مختلف کارایی کاتالیتیکیkcat/km)) متفاوتی از خود نشان می دهند؛ بنابراین پایداری فعالیت آنها در حلالهای مختلف متفاوت است . فورمامید: چنانچه طیف فلورسانس نشان می دهد به نظر می رسد که ساختار باز شده و فورمامید سبب واسرشتگی ساختار آنزیم شده است همچنین، در حضور فورمامید غلظت v/v 1% فورمامید، دمای بهینه فعالیت آنزیم بالاتر رفته و حدود c°30 است (دمای بهینه فعالیت آنزیم بدون وجود حلال های آلی c° 25 است). در حضور غلظت (v/v) 1% فورمامید فعالیت افزایش یافته و هر چه غلظت بالاتر می رود فعالیت کاهش می یابد؛اما نمودار پایداری حرارتی متناسب با کنترل سیر نزولی دارد .در حضور غلظت (v/v) 10% ، ph بهینه و پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph تغییری نشان نمی دهد (8/7 ph )سرعت کاهش نشر نور نیز در حضور فورمامید نسبت به نمونه کنترل کاهش می یابد. اتانول: بررسی طیف فلورسانس آنزیم در حضور اتانول نشان می دهد که در غلظتهای پایین اتانول(تا حدود (v/v) 10% )، به شدت فلورسانس ذاتی کاهش می یابد ولی با افزایش تدریجی در صد اتانول، ساختار آنزیم به حالت کنترل نزدیک می شود .دمای بهینه فعالیت آنزیم و پایداری حرارتی در غلظت های مختلف اتانول تغییری نشان نمی دهد و تنها فعالیت آنزیم کاهش یافته است. ph بهینه فعالیت آنزیم در حضور اتانول در مقایسه با نمونه کنترل کاهش نشان می دهد(7) .اما پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph کمی بیشتر می شود. سرعت کاهش نشر نور نیز کاهش می یابد. اتیلن شدت فلور سانس به طور منظم با افزایش در صد اتیلن گلیکول افزایش می یابد همچنین طبق بررسی طیف cd ساختار دوم آنزیم هم تغییر می کند و با افزایش درصد اتیلن گلیکول فعالیت آنزیم نیز کاهش نشان می دهد. دمای بهینه و پایداری حرارتی در حضور اتیلن گلیکول نسبت به نمونه کنترل تغییری نشان نمی دهد و تنها فعالیت آنزیم کمتر می شود و نمودارهای پایداری حرارتی متناسب با نمونه کنترل کاهش می یابند. ph بهینه فعالیت آنزیم افزایش یافته(ph=8) اما پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph تغییری نشان نمی دهد. سرعت کاهش نشر نور در حضور اتیلن گلیکول کاهش می یابد . dmso : در مورد dmso نیز در طیف فلورسانس در ابتدا با افزایش در صد دی متیل سولفوکسید، شدت فلورسانس کاهش یافته و پس از آن با افزایش آن شدت طیف افزایش می یابد. دمای بهینه فعالیت آنزیم در حضورdmso نسبت به نمونه کنترل افزایش تا حدود ?c 30 و پایداری حرارتی به خصوص غلظت (v/v) 15% افزایش نشان می دهد. ph بهینه فعالیت آنزیم در حضور غلظت 10% dmso در محدوده گسترده تری است و پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph افزایش می یابد .سرعت کاهش نشر نور با افزایش غلظت dmso کاهش می یابد .

چکیده: فرایند بیولومینسانس به نشر نور توسط بعضی از موجودات زنده اطلاق می شود. نمونه مشهور موجودات تولید کننده ی نور، کرم شب تاب یا firefly می باشد. این فرایند در اثر واکنش سوبسترای لوسیفرین با o2 در حضور آنزیم لوسیفراز، mg2+ و مصرف انرژیatp همراه می باشد که باعث تولید اکسی لوسیفرین در حالت برانگیخته شده و برگشت اکسی لوسیفرین به حالت پایه باعث نشر نور می گردد. محققین از دیرباز برآن شدند تا بتوانند از سیستم نورزایی در فرآیند های بیولوژیکی و صنعتی استفاده نمایند. نتایج تحقیقات تعدادی از محققین نشان می دهد که آمین دار کردن حلقه آروماتیک لوسیفرین سبب تولید نور قرمز می گردد و نور قرمز به دلیل طول موج بلند و انرژی پایین قادر به خروج از بافت موجود زنده خواهد بود. این تحقیق روشهای سنتز شیمیایی آمینو لوسیفرین را نشان می دهد. از آنجاییکه ماده مذکور کمیاب و گران قیمت می باشد، لذا سنتز آن بطریق شیمیایی ضروری تشخیص داده شد. ماده ی اولیه ی سنتز 2-کلروبنزوتیازول می باشد. ابتدا حلقه ی بنزنی در ساختار بنزوتیازول، نیتره شده و سپس به آمین تبدیل شد. پس از این مرحله سیانید به جای کلر در حلقه ی تیازول قرار گرفت و در مرحله ی نهایی با د- سیستئین هیدروکلراید مونو هیدرات حلقه زایی انجام و آمینو لوسیفرین سنتز شد.طیف مادهء سنتز شده بوسیله دستگاه 500 nmr بررسی ومورد تائید قرار گرفت، همچنین اثر نشر لومینسانیس ماده سنتز شده تحت تاثیر آنزیم لوسیفراز، atpوmg2+ قرار گرفته و بوسیله دستگاه لومینومتر مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

پیشرفت های اخیر در زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی گیاهی تصور عمومی را در مورد کاشت گیاهان به صورت سنتی و فقط به عنوان یک منبع غذایی به سمت اینکه گیاهان می توانند در نقش کارخانه های زیستی جهت تولید پروتئین های نوترکیب و دارویی ظاهر شوند تغییر داده است. گیاهان به دلیل توانایی تولید نامحدود در تعداد و مقدار پروتئین های ایمن و ارزان نوترکیب دارای قابلیت کشاورزی زیستی هستند. تحقیقات گسترده در دو دهه اخیر نشان داده است که دامنه وسیعی از پروتئین های مهم و ضروری می توانند به طور موثری در گیاهان بیان شوند. نمونه هایی شامل پروتئین های سرم و فاکتورهای رشدی، آنتی بادی ها، واکسن ها، آنزیم های تجاری، پلیمرهای زیستی و معرف های مولکول های زیستی وجود دارند.(.,2000.fischer and mans) آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب یکی از مهمترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان atp به منظور تشخیص آلودگی های میکروبی، تهیه کیت های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست حسگرها، همچنین در بررسی روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین ها، سنجش های آنزیمی و توالی یابی dna (pyrosequencing) استفاده می شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شب تاب گونه ایرانیlampyris turkestanicus و بررسی امکان سنجی تولید آن در گیاه کلزا انجام گرفت. در این تحقیق، ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) که در ناقل بیانی pcambia1304 که تحت پیشبرنده s35 ویروس موزایک گل کلم (camv 35s) همسانه سازی شده بود توسط روش ذوب و انجماد به باکتری agrobacterium tumefaciens سوش lba4404 منتقل و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد. سپس پلاسمید نو ترکیب شامل ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) به کمک باکتری آگروباکتریوم به گیاه کلزا منتقل گردید. ریزنمونه های لپه ای از گیاه کلزا رقم pf4570/91 برای تراریخت سازی مورد استفاده قرار گرفت.. جهت تعیین آستانه تحمل گیاه کلزا به آنتی بیوتیک هیگرومایسین غلظت های مختلف این آنتی بیوتیک مورد بررسی قرار گرفت. گیاهان تراریخت بر روی محیط ms حاوی آنتی بیوتیک هیگرومایسین و سفوتاکسیم انتخاب شدند. گیاهچه های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. گیاهچه ها پس از ریشه دار شدن، ابتدا به گلدان حاوی پرلایت و در نهایت به خاک منتقل شدند آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت وجود ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) را در گیاهان تراریخت تأیید نمود. از گیاهان شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی pcr استفاده گردید.

بیوهیدرومتالورژی یکی از شاخه های علم متالورژی می باشد که از دانش میکروبیولوژی برای استخراج فلزات بهره برده است. روش های لیچینگ میکروبی به منظور بازیافت فلز از سولفید های معدنی کم عیار کاربرد دارد. مهمترین باکتریهای دخیل در لیچینگ فلزات از سنگ های معدن، اسیدیتیوباسیلوس فرواکسیدانس و لپتوسپیریلیم فرواکسیدانس می باشد. این باکتریها از جایگاه های لیچینگ صنعتی و طبیعی جداسازی می شوند. هدف از انجام این پژوهش جداسازی باکتری اسیدیتیوباسیلوس فرواکسیدانس بومی مزوفیل دخیل در فرایند بیولیچینگ مس و بهینه سازی آن می باشد. نمونه گیری از محلول زیر هیپ صورت گرفته و تلقیح در محیط های مایع سنتزی پایه نمکی به منظور جداسازی این باکتری انجام شد. بعد از خالص سازی نسبی باکتری مورد نظر، خالص سازی نهایی در محیط های کشت جامد سنتزی پایه نمکی طراحی شده تولید کلونی از این باکتری صورت گرفت. سپس، به دست آوردن شرایط بهینه این باکتری در دماهای 25، 28 و 30 درجه سانتیگراد، ph های 5/1، 5/2 و 5/3 و حرکت های دورانی rpm140، 150 و 160 انجام شد. پس از آن بررسی رشد باکتری در حضور منابع نیتروژنی مختلف و منابع انرژی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. جهت بررسی رشد باکتری ها، od، غلظت پروتئین به روش برادفورد، غلظت آهن فریک و غلظت یون cu+2 اندازه گیری شد. نتایج حاصل از آزمایش نشان دهنده بهینه بودن باکتری در دمای 30 درجه سانتیگراد، ph برابر 5/2 و حرکت دورانی معادل rpm160 می باشد. علاوه بر آن رشد باکتری جداسازی شده در حضور فلزات zn+2، cd+2 و co+2 در هفت غلظت متفاوت از هر کدام از این فلزات شامل ppm310، 210، 110، 10 و g/l30، 20 و 10 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دهنده رشد باکتری در حضور g/l30 فلز روی در محیط کشت می باشد. اما باکتری حساسیت بیشتری به حضور مقادیر کم کادمیوم و کبالت در محیط کشت نشان می دهد.

اکورین فوتوپروتئینی است که اولین بار از نوعی عروس دریایی بنام aequoera victoria کشف شد، که قادر است از خود نور آبی رنگ ساطع نماید. بدلیل حساسیت بالای اکورین به غلظت کلسیم و با توجه به اینکه در این پروتئین، درصد سیگنال نسبت به نویز پس زمینه، بسیار بالا است ، از این فوتوپروتئین در حوزه های مختلف زیست فناوری استفاده های زیادی می شود. در این پژوهش طی سه مرحله بر روی این پروتئین تحقیقات صورت گرفت: 1- فوتوپروتئین نوترکیب، در سیستم بیانی pet 21a(+) کلون و بیان گردید. پس از خالص سازی ، اکورین نوترکیب مورد آنالیز ساختاری ، سینتیکی ، پایداری حرارتی، خاموش کنندگی و پروتئازی در حضور چند پایدارکننده قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش پایداری و فعالیت اکورین تولیدی در حضور سوربیتول با کمترین تاثیر در هضم پروتئازی و خاموش کنندگی با آکریل آمید می باشد. 2- جهش های شیفت نوری و تغییر زمان تضعیف نشر نور در سه جهش y82f، w86f و d153g بصورت تک و دوتایی صورت گرفت. براین اساس شش پروتئین جهش یافته با نامهای aeq-82 ، aeq-86 ، aeq-153 ، aeq-82/86 ، aeq-82/153 و aeq-86/153 بدست آمد. در ادامه جهش های حاصله از نظر شیفت نوری، مدت زمان تضعیف نشر نور و پایداری حرارتی مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد بیشترین طول موج نشر نوری از 457 نانومتر(aeq.) به 400 (aeq-82/86) و 478 (aeq-82 و aeq-82/153)نانومترتغییر یافته است. از سوی دیگر t1/2 یعنی مدت زمانی که فعالیت فوتوپروتئین، به 50 درصد اولیه می رسد، از 0.7 ثانیه(aeq.) به 3.7 (aeq-82)ثانیه افزایش یافته است. همچنین بنظر می رسد دو جهش aeq-86 و aeq-82/153 ، سبب افزایش پایداری حرارتی پروتئین در استرس دمایی 65 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه، شده است. 3- در بخش سوم از تحقیقات، از اکورین بعنوان آنزیم گزارشگر جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک نظیر تولوئن و بنزن در قالب یک حسگر زیستی باکتریای استفاده شد. در این پژوهش از اجزاء اپرون xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 استفاده گردید. به این صورت کهcdna فاکتور فعال کننده نسخه برداری یعنی xylr که در حضور ترکیبات آروماتیک فعال می شود و در دانشگاه مالک اشتر در داخل پلاسمید pgl2 کلون و با نام pgl2-px ثبت گردیده بود، مورد استفاده قرار گرفت. از سوی دیگر، بعد از پروموتور pu (که بوسیله پروتئین xylr فعال می شود) فوتوپروتئین اکورین همراه یا بدون حضور توالی شاین دالگارنو (sd) یا توالی ختم رونویسی rrnb)) در منطقه بالادستی آن کلون گردید. سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109 ،ترانسفورم گردید. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای باکتری jm109 طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولیدی در ادامه مورد آنالیز فعالیت براساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن به جای روش های مرسوم شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) می باشد.

پیرووات کیناز آنزیمی کلیدی در مسیر گلیکولیز است که انتقال یک گروه فسفر از فسفو انول پیرووات به adp را کاتالیز نموده و منجربه تولید پیرووات و atp می شود. با توجه به اهمیت بالای این آنزیم در اکثر موجودات زنده، و استفاده روزافزون از آن در زمینه های گوناگون، مراحل تخلیص این آنزیم، به منظور آشنایی بیشتر با خصوصیات نوعی پیرووات کیناز متعلق به یک geobacillus بومی ایران، که قبلا در وکتور pet-28a کلون شده بود، انجام شد. پس از آن برای شناسایی نقاط انعطاف پذیر و در دسترس این آنزیم از تکنیک پروتئولیز محدود در حضور دو پروتئاز تریپسین و ترمولیزین استفاده شد. با توجه به ویژگی های سوبسترایی متفاوت این پروتئازها و قابلیت فعالیت آنها در دماهای متفاوت، اطلاعات مفیدی در رابطه با دمین های ساختاری پیرووات کیناز مورد مطالعه به دست آمد. سپس تاثیر گلایسین، سوکروز و mg2+ به طور جداگانه بر الگوی پروتئولیز در دمای ?c60 بررسی شد. مطالعات طیف جذبی آنزیم پیرووات کیناز در حضور این افزودنی ها تغییر در شکل فضایی پیرووات کیناز را نشان داد. سرعت پروتئولیز در حضور افزودنی ها کاهش یافت اما نقاط مستعد جدیدی در معرض قرار نگرفت و نقاط قبلی نیز همچنان نسبت به پروتئولیز حساس بودند. نتایج این مطالعات به تفسیر و شناسایی قطعات حاصل از پروتئولیز کمک نمود. فعالیت آنزیمی پیرووات کیناز نیز در تمام مراحل به صورت سنجش همراه با آنزیم لوسیفراز محاسبه شد. در نهایت به منظور تعیین خصوصیات دقیق و نیز نقاط مستعد پروتئولیز، جداسازی قطعات حاصل از پروتئولیز محدود به کمک روش الکتروفورز preparative انجام شد.

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب (luc) یکی از مهم ترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف پزشکی، علوم گیاهی و بیولوژی سلولی و مولکولی کاربرد دارد. این آنزیم، به دلیل داشتن خصوصیاتی هم چون حساسیت بالا، تکرارپذیری مطلوب و قابلیت اندازه گیری کمی آن، کاندیدای بسیار مناسبی در زمینه تصویربرداری های بیولومینسانس در شرایط طبیعی و در سیستم های گزارشگر به منظور بهینه سازی سیستم های انتقال ژن و تولید موجودات تراریخت می باشد. تحقیق حاضر جهت همسانه سازی و انتقال ژن لوسیفراز حشره شب تاب گونه ایرانیl. turkestanicus با نشر نور قرمز در گیاه بنفشه آفریقایی (saintpaulia ionantha) انجام گرفت. خصوصیاتی هم چون داشتن رنگ و شکل متنوع، قابلیت رشد در شرایط اتاق، توانایی گل دهی تحت نور مصنوعی و تکثیر رویشی آسان در تمام فصول سال باعث محبوبیت این گل در میان گل های زینتی شده است. برای جداسازی و تکثیر ژن لوسیفراز (luc)، آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های دو انتها، محل های برشی آنزیم های مناسب و توالی افزایش دهنده بیان گیاهی (kozak sequence) طراحی و ژن مورد نظر پس از جداسازی، در ناقل بیانی pcambia1304 همسانه سازی شد. ناقل نوترکیب جدید (pcamluc) با استفاده از بررسی های colony pcr،pcr ، هضم آنزیمی، توالی یابی و همردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی (genbank)، مورد تایید قرار گرفت. ژن هدف به کمک باکتری آگروباکتریوم سویه lba4404 به گیاه بنفشه آفریقایی منتقل گردید. گیاهان تراریخت بر روی محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم باززایی شدند. آنالیز گیاهان تراریخت با آزمون pcr، rt-pcr و سنجش لومینومتری انجام گرفت.

در این مطالعه پایداری ترمودینامیکی و سینتیک بازتاخوردگی لوسیفراز و سه جهش یافته از آن که در آن ها بار منفی سطحی موجود بر روی یک لوپ انعطاف پذیر از طریق جایگزینی گلوتامیک اسید توسط آرژینین (جهش یافته er) یا توسط لیزین (جهش یافته ek) و همچنین وارد کردن یک رزیدوی آرژینین دیگر در جهش یافته er (جهش یافته err) کاهش یافته بود، مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس مطالعات ترمودینامیکی، پایداری ساختاری جهش یافته های err و er در مقایسه با پروتئین وحشی افزایش یافته بود، اگرچه این جهش یافته ها در دماهای بالاتر مستعد تشکیل رسوبات پروتئینی بودند. بنابراین نتیجه گیری شد که افزایش پایداری ساختاری این جهش یافته ها وابسته به فشردگی بیشتر ساختار در حالت طبیعی و کاهش آنتروپی لوپ در نتیجه برقراری میانکنش های کوتاه برد درون مولکولی جدیدی از نوع آبگریز و الکترواستاتیک می باشد. در حالی که تشکیل رسوبات پروتئینی در دماهای بالاتر در ارتباط با رقابت بین میانکنش بین مولکولی دافعه از نوع الکترواستاتیک و جاذبه از نوع آبگریز است که مورد اولی در اثر افزایش دما تضعیف و دومی با افزایش دما تقویت می شود به طوری که با افزایش دما احتمال به هم چسبیدن پروتئین های جهش یافته بالا می رود. مطالعات سینتیکی نشان دادند که وقایع اولیه در فرآیند بازتاخوردگی لوسیفراز شامل تبدیل حالت واسرشته به حدواسط در این جهش یافته ها افزایش می یابد. این مرحله با تبدیل حالت حدواسط به حالت طبیعی نهایی و از طریق مرحله کند کننده حالت گذار ادامه پیدا می کند. مقادیر m ترمودینامیکی و سینتیکی نشان می دهند که ساختار لوپ در پروتئین های جهش یافته به میزان کمتری تحت تاثیر فرآیند غیر طبیعی شدن شیمیایی قرار می گیرد و لوپ در حالت واسرشته دارای عناصر باقیمانده ای از ساختار منظم است در حالی که در حالت طبیعی فشرده تر می باشد. نکته جالب این است که این اثرات ساختاری در جهش یافته های مورد مطالعه توام با تغییر خواص طیف نشری بیولومینسانس می باشد.

به فرایند تولید نور در سیستم های زیستی بیولومینسانس اطلاق می شود. در فرایند نور افشانی حشرات شبتاب، آنزیم بازیافت کننده لوسیفرین (lre) عملکرد کلیدی در بازیافت لوسیفرین از اکسی لوسیفرین دارد. در این مطالعه، lre گونه ایرانی lampyris turkestanicus با استفاده از روش های مبتنی بر race (5/-race و 3/-race) و rt-pcr تکثیر و کلون شده است. بررسی توالی cdna حاصل نشان می دهد که توالی کامل t-lre به طول 924 جفت باز توانایی کد کردن پروتئینی به طول 307 آمینواسید را دارد. بعلاوه بررسی توالی حاصل مشخص کرد که t-lre دارای 46 و 45 درصد همسانی با توالی های a-lre (از گونه photinus pyralis) و g-lre ( از گونه luciola cruciata) است. توالی t-lre به صورت فعال در با کتری e. coli بیان شد و قابلیت افزایش نشر نور آنزیم لوسیفراز در سنجش جفت شده نشان داده شد. در ادامه بیان t-lre در سیستم بیانی پروکاریوتی تحت شرایط مختلف شامل استفاده از فولدازهای شیمیایی، بیان همزمان با چپرون های سلولی و استفاده از فناوری پروتئین الحاق شده بررسی شد. بعلاوه بررسی بیان t-lre در سیستم بیانی pichia pastoris انجام گرفت. در نهایت مطالعات بازتاخوردگی t-lre با روش های مختلف مطالعه شده است.

آپوپتوز یک مسیر فیزیولوژی مهم در تکوین و هموستازی موجودات چند سلولی می باشد. مشکلات ناشی از عدم تنظیم آپوپتوز در تعدادی از بیماریها دیده می شود. ارزیابی ترکیبات دارویی علیه عوامل بهم زننده آپوپتوز بهتر است که با روش های تصویر برداری غیر تهاجمی از مولکول های حد واسط ویژه آپوپتوز صورت گیرد. چون کاسپازها نقش کلیدی در آغاز و ادامه آبشار آپوپتوز دارند، توانایی تصویربرداری غیر تهاجمی از فعال شدن پیش ساز این آنزیم ها فرصت مناسبی برای ارزش گزاری ترکیبات دارویی در موجودات زنده را فراهم می کند. از آنجایی که در طول مسیر آپوپتوز در اکثر سلول ها کاسپاز 3 فعال می شود و وجود کاسپاز 3 برای بقای موجود ضروری می باشد، طراحی گزارشگری که بتواند میزان فعالیت کاسپاز 3 را نشان دهد، برا ی کشف ترکیبات جدیدی با خاصیت درمانی بسار مفید خواهد بود. جابجایی حلقوی در ساختار پروتیین چیدمان جدیدی از توالی آمینو اسیدی آن می باشد. طوری که انتهای آمینی وکربوکسیل پلی پپتید را به هم وصل می کنیم وانتهای دیگری ایجاد می-کنیم. به دلیل راحتی تشخیص نور، لوسیفراز حلقوی جابجا شده کاندیدای مناسبی برای طراحی گزارشگرها می باشد. در این مطالعه پلاسمید نوترکیب حاوی لوسیفراز حلقوی جابجا شده با محل برش کاسپاز 3 ساخته شد. لوسیفراز حلقوی جابجا شده به دلیل ساختارش فعالیت بیولومینسانسی کمی داشت. پس از شناسایی و برش توسط کاسپاز 3 فعالیت آن افزایش یافت. سپس مطالعات ساختاری روی پروتئین گزارشگر جدید انجام شد.

adp در بسیاری از واکنش های بیولوژیک شرکت می کند و کیت سنجش adp برای سنجش واکنش های آنزیمی با دنبال کردن تشکیل یا مصرفadp استفاده می شود. تاکنون چندین روش برای سنجش adpراه اندازی شده است. یکی از این روش ها بر اساس تبدیل یک به یک adp به atp توسط آنزیم پیروات کیناز، در حضور مقادیر مختلف adp و به دنبال آن اندازه گیری atp تشکیل شده توسط لوسیفرین-لوسیفراز می-باشد. با توجه به نقش کلیدی آنزیم پیروات کیناز (ec 2.7.1.40) در این سنجش ژن کدکننده این آنزیم از باکتری گرمادوست ژئوباسیلوس، در ناقل بیانی pet28-a (+) و باکتری اشریشیاکولی bl-21، کلون، تعیین توالی و بیان شد. این ژن به طول 1764 جفت باز توانایی کدکردن پروتئینی به طول 587 باقیمانده اسید آمینه را دارد. توالی نوکلئوتیدی ژن پیروات کیناز و توالی آمینواسیدی آن %100 مشابه آنزیم پیروات کیناز geobacillus kaustophilus hta426 می باشد. پروتئین نوترکیب به روش کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شد. آنزیم خالص سازی شده برای اندازه گیری adp به روش واکنش جفت شده توسط بیولومینسانس استفاده شد. ویژگی های بیوشیمیایی از قبیل پارامترهای سینتیکی، اثر دما بر پایداری آنزیم، اثر ph و نیز مطالعات ساختاری cd بررسی شد. پارامترهای سینتیکی نشان داد که این آنزیم نسبت به سوبسترای pep، فرآیند تعاونی مثبت هموتروپیک با k0.5 برابر 3/1 میلی مولار اما برای adp با سینتیک میکائیلیس- منتن با km برابر2 میلی مولار با ماکزیم فعالیت در ph برابر با 5/7 و دمای 65 درجه سانتیگراد می باشد.

بابونه کبیر(tanacetum parthenium l. schulz bip.) گیاهی است چند ساله و دیپلویید (2n=2x=18)، از خانواده گل ستاره ای ها (asteraceae) که در طب سنتی به عنوان کاهش دهنده تب استفاده می شود. ماده موثره اصلی بابونه کبیر پارتنولید است که اخیراً توجه زیادی را به علت ارزش دارویی و فعالیت های فارماکولوژیکی خصوصاً به عنوان پیشگیری کننده میگرن و درمان سرطان به خود جلب کرده است. از نظر ساختار شیمیایی، پارتنولید یک سزکویی ترپن لاکتون می باشد که گفته می شود به طور عمده از مسیر (mevalonic acid) mva بیوسنتز می شود. اخیراً نشان داده شده است که مسیر mva و مسیر mep (methyl erythritol phosphate) از طریق تبادل پیش ماده ipp (iosopentenyl diphosphate) برای بیوسنتز ترپن های مختلف با هم در ارتباط می باشند، بنابراین بیوسنتز پارتنولید می تواند تحت تاثیر مسیر mep نیز قرار بگیرد. در تحقیق حاضر، میزان پارتنولید در بافت های مختلف با uplc-ms/ms اندازه گیری شد. به دنبال آن با استفاده از cdna مربوط به بافت گل که بیشترین میزان پارتنولید را تجمع می کرد، توالی کامل دو ژن کلیدی مسیر mva یعنی tphmgr و tpgas و دو ژن کلیدی مسیر mep یعنی tpdxr و tpids با استفاده از تکنیک race pcr برای اولین بار جداسازی و تعیین ویژگی شد. بررسی میزان بیان پارتنولید و الگوی بیان این ژن ها در سطح رونوشت با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (real time pcr) در بافت های مختلف، مراحل مختلف نموی و ژنوتیپ های مختلف نشان داد که میزان پارتنولید و الگوی بیان این ژن ها تحت تاثیر هر کدام از عوامل ذکر شده متفاوت است. بیشترین میزان همبستگی، بین میزان پارتنولید و میزان رونوشت ژن tpgas مشاهده شد. میزان بالای بیان ژن tpgas به همراه میزان بالای پارتنولید در کرک های غده ای بابونه کبیر نشان داد که این بافت های ترشحی به عنوان محل اصلی بیوسنتز و تجمع پارتنولید عمل می کنند. علاوه براین القای تتراپلوییدی در بابونه کبیر نشان داد که ژنوتیپ تتراپلویید نسبت به ژنوتیپ دیپلویید مشتق شده داری میزان بیشتری از پارتنولید در برگ و گل می باشد که این افزایش با توجه به داده های به دست آمده می تواند در اثر افزایش بیان ژن tpgas باشد.

به فرآیند تولید نور در سیستم های زیستی، اصطلاحاً بیولومینسانس گفته می شود. آنزیم های درگیر در این فرآیند با نام کلی لوسیفراز نام گذاری می شوند. لوسیفرازها برای انتشار نور از سوبسترای لوسیفرین همراه با mg+2 و atp استفاده می کند. گونه ایرانی لوسیفراز که در جنگل های شمال ایران یافت می شود، نور سبز را نشر می کند. فاکتورهای مختلفی بر روی رنگ نور نشری از لوسیفراز تأثیر می گذارد که از آن جمله می توان به ایجاد جهش در برخی از اسیدهای آمینه درگیر در ساختار لوسیفراز اشاره کرد. لوسیفراز جهش یافته ایرانی که از خود نور قرمز ساطع می کند، توسط خیرآبادی و همکارانش تعیین ساختار شد. در این تحقیق، ساختار لوسیفراز وحشی گونه ایرانی توسط روش بلورنگاری پرتو x تعیین گردید و داده های گردآوری شده بیانگر حدتفکیک ? 7/2 و با تقارن tetragonalبوده و آنالیز نقشه چگالی الکترونی لوسیفراز گونه وحشی گویای تطابق بالای دُم انتهای آمینی با مدل (pdb code:1lci)می باشد. انطباق دو ساختار وحشی و جهش یافته گونه ایرانی، صورت بندی متفاوتی را در لوپ انعطاف پذیر 359-351 نشان می دهد. لوپ در لوسیفراز جهش یافته دارای یک برآمدگی قابل توجه در این ناحیه است. این تغییر در صورت بندی به علت اشباع بار مثبت در لوپ 359-351 در نتیجه وارد شدن دو رزیدوی arg با بار مثبت می باشد. چگالی الکترونی در ناحیه انتهای کربوکسی بسیار ضعیف بوده و تطابق بین چگالی الکترونی و مدل حاصل نشد. با توجه به اینکه دُمین انتهای کربوکسی در لوسیفراز جهش یافته نیز دیده نشده، می توان انعطاف پذیری بالای انتهای کربوکسی را دلیل عدم مشاهده آن دانست. همچنین با مقایسه دو رزیدوی کلیدی در glu311 که به عنوان رزیدویی با اهمیت در جایگاه فعال شناخته شده است و arg337 که نقش حد واسط جهت ایجاد میانکنش بین glu311 و لوپ 359-351 و هم چنین لوپ 235-223 را دارد، نشان داد که glu311 در گونه جهش یافته با مولکولهای آب اطراف خود چندین میانکنش ایجاد کرده است. در حالیکه در گونه وحشی فاقد پیوند هیدروژنی با مولکولهای حلال اطراف خود می باشد. هم چنین میانکنش های arg337 با لوپ انعطاف پذیر در گونه جهش یافته نسبت به گونه وحشی متفاوت بوده و چنین به نظر می رسد که با وارد شدن arg356 و همچنین تغییر glu354 به arg و چرخش فضایی متفاوت arg354 نسبت با glu، میانکنش های آن هم تغییر کرده و تنها با thr352 میانکنش ایجاد می کند. با توجه به مطالعات خیرآبادی و همکارانش بر روی انرژی الکترواستاتیک glu354 در حالت جهش یافته مبنی بر قطبیت بالاتر ریزمحیطی این رزیدو نسبت به سایر لوسیفرازها، می توان این طور نتیجه گرفت که جهش های ایجاد شده در لوسیفراز گونه ایرانی (e354r/r356/h431y)، باعث تغییراتی در حرکات کوتاه بُرد وبلند بُرد پروتئین شده و درنهایت نفوذپذیری آب را به درون آن افزایش داده است. این افزایش نفوذپذیری آب به درون ساختار، موجب تغییر رنگ نور انتشار یافته لوسیفراز جهش یافته می گردد.

به فرآیند تبدیل انرژی شیمیایی به انرژی مرئی نورانی توسط موجودات زنده بیولومنیسانس گویند و امروزه با توجه به بالا بودن درصد سیگنال فوتون به نویز پس زمینه، بیولومینسانس کاربرد های زیادی در حوزه های مختلف علوم زیستی پیدا نموده است. تا کنون هشت نوع فتوپروتئین وابسته به کلسیم گزارش شده که از این میان تنها فتوپروتئین نمیوپسین از شانه دار mnemiopsis leidyi تعیین توالی و بصورت نوترکیب بیان نشده است. در این تحقیق، بعد از جمع آوری شانه دار نمیوپسیس لیدی از دریای خزر و انجام فرایند های استخراج rna، ساخت cdna، طراحی پرایمر، pcr، t/a cloning، subcloning در وکتور بیانی pet28a و انتقال به سویه بیانی bl21(de3)، توالی ژنی بدست آمده در بانک ژنی با کد دسترسی gq884175 ثبت گردید. نتایج حاصل از تعیین توالی بیانگر جایگزینی گلوتامیک اسید به جای گلایسین حفاظت شده در لوپef-hand اول نمیوپسین بود بنابراین بررسی این تغییرات بر عملکرد پروتئین می توانست قابل توجه باشد از این رو با استفاده از جهش زایی هدف دار، جهش e50g انجام شد. سپس به تعیین ویژگیهای فتوپروتئین نوترکیب طبیعی و جهش یافته نظیر ph مطلوب، دمای مطلوب، شرایط بیانی مطلوب ( میزان بیان در دما ها، زمان ها و غلظت های مختلف القاء کننده ها)، میزان حساسیت به کلسیم، شرایط انکوباسیون (مدت زمان انکوباسیون و غلظت کلنترازین) پرداخته شد. نتایج نشان دادند که بیان پروتئین در دمای 30 درجه سانتی گراد، با 6 ساعت انکوباسیون بعد القاء در غلظت یک میلی مولار iptg افزایش یافته است. نتایج تعیین ویژگی فتوپروتئین طبیعی و جهش یافته، بیانگر حساسیت فوق العاده زیاد نمیوپسین طبیعی و جهش یافته به تغییرات ph می باشد. به طوری که میزان فعالیت فتوپروتئین ها در ph برابر 9 تا حد قابل ملاحظه ای با سایر ph ها متفاوت است علت این حساسیت با استفاده از بررسی تغییرات pka در ph مختلف با استفاده از نرم افزار macrodox در مقایسه با فتوپروتئین آکورین توجیه گردید. همچنین بررسی ها نشان دادند که مدت زمان لازم برای بازسازی و همچنین غلظت مطلوب کلنترازین نمیوپسین در مقایسه با آکورین بیشتر می باشد که بررسی توالی و ساختار نمیوپسین با آکورین نیز علت این تفاوت را روشن نمود. ادامه بررسی ها نیز کاهش میزان حساسیت به کلسیم نمیوپسین نوترکیب طبیعی و جهش یافته در مقایسه با آکورین را تائید کردند. آنالیز توالی نمیوپسین و نتایج motif scan نشان داد که در نمیوپسین طبیعی لوپ ef-hand اول قابلیت اتصال به کلسیم خود را از دست داده است و هر چند میزان حساسیت به کلسیم نمیوپسین جهش یافته نسبت به طبیعی افزایش یافته اما در مقایسه با اکورین همچنان حساسیت پایین می باشد. بررسی بهترین دمای لازم جهت فعالیت پروتئین ها نشان دهنده حساسیت به دما در این پروتئین ها می باشد. با استفاده از مطالعات ساختاری، نظیر دورنگ نمایی دورانی، فلورسانس و ft-ir، ساختار دوم و سوم پروتئین ها بررسی و نتایج نشان دهنده افزایش فشردگی ساختار نمیوپسین جهش یافته نسبت به طبیعی و افزایش چرخش بتا نمیوپسین جهش یافته و کاهش پیچه نامنظم آن بودند. در نهایت با استفاده از همولوژی مدلینگ، مدل نمیوپسین نوترکیب طبیعی، جهش یافته و آکورین در حضور کلسیم و کلنترازین برای استفاده در محاسبات تئوری ساخته شد.

حسگر زیستی باکتریایی به باکتری هایی اطلاق می شود که از لحاظ ژنتیکی به نحوی طراحی شده اند که قادرند در حضور یک عامل فیزیکی یا شیمیایی در محیط، یک سیگنال قابل اندازه گیری تولید کنند. این حسگر ها از دو بخش: پروموتر (که حضور عامل هدف را تشخیص می دهد) و ژن گزارشگر (که به پروموتر متصل بوده و تولید سیگنال زیستی می کند) تشکیل شده است. حسگرهای زیستی واجد توانایی بسیار بالایی در تشخیص آلودگی های محیطی هستند. در این تحقیق ساخت، حساسیت و اختصاصیت دو حسگر زیستی با استفاده از پروموتر اپرون pbr به همراه ژن تنظیمی pbrr از پلاسمید pmol30 متعلق به باکتری رالستونیا متالیدورانس و پروموتر اپرون cada به همراه ژن تنظیمی cadc از پلاسمید pi258 متعلق به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد بررسی قرار گرفت. از ژن لوسیفراز کرم شب تاب به عنوان گزارشگر استفاده شد. حسگر ساخته شده توسط ناحیه پروموتری pbr و ناحیه پروموتوری cada به ترتیب pgl3- luc/pbr-biosensor و pgl3-luc/cad-biosensor نامگذاری شد. از باکتری e.coli سویه dh5? به عنوان میزبان استفاده شد. نتایج به دست آمده نشان داد که حسگر زیستیpgl3-luc/pbr-biosensor قادر است، غلظت-های بین 100-1 میکرومولار سرب را تشخیص دهد و می تواند نسبت به سرب به صورت اختصاصی عمل کرده و در حضور فلزاتی مثل روی، کادمیوم، قلع و نیکل، بیان ژن گزارشگر مشاهده نشد. علاوه بر این، نسبت به حسگر ساخته شده توسط chakraborty (با ناحیه پروموتری یکسان) 50 برابر حساسیت بیشتری دارد. حسگر pgl3-luc/cad-biosensor قادر است غلظت های بین ?? نانومولار تا ?? میکرومولار سرب را تشخیص دهد. این حسگرنسبت به سرب به صورت اختصاصی عمل نکرده و حضور کادمیوم در محیط نیز می تواند باعث فعال شدن پروموتر و بیان ژن گزارشگر شود. کلمات کلیدی: حسگر زیستی باکتریایی، پروموتر اپرون pbr، پروموتر اپرون cada، فلزات سنگین، آلودگی، تشخیص، لوسیفراز

نانولیپوزوها ذرات کلوییدی می باشند که از دو لایه متشکل از مولکولهای چربی تشکیل شده اند. این ترکیبات محفظه هایی را تشکیل می دهند که ذرات معلق بین آنها به دام می افتند. وزیکولهای لیپوزومی به دلیل اینکه توانایی پتانسیل حمل مولکولهای فعال زیستی را دارند، کاربردهایی را در درمان بیماریهای انسان وحیوان پیدا کرده اند. از این رو توجه محققان به این ترکیبات جلب شده است. لیپوزومها مدلی از غشای بیولوژیک می باشندو اخیرا به عنوان حامل برای انتقال ژن و دارو به ارگان های هدف مورد استفاده قرار می گیرند.از این رو از لیپوزومها در درمان بیماریهای سرطان استفاده می شود. تحقیقات اخیر نشان می دهد که لیپوزومهای کاتیونی توانایی به دام اندازی اسید های نوکلئیک و انتقال آنها به سلولهای هدف را دارند. لیپوزومها کاتیونی به دلیل سمیت پایین، آماده سازی آسان،وابسته نبودن به سایز اسیدنوکلئیک و هزینه کم به عنوان یکی از گسترده ترین سیستمهای غیرویروسی برای انتقال ژن مورد استفاده قرار می گیرند. راههای مختلفی برای افزایش کارایی ترانسفکشن لیپوزوم ها انجام شده است که می توان به استفاده از لیگاندها برای هدفنمد سازی آنها، استفاده از ترانسفرین، استفاده از آنتی بادی هاو سایر موارد اشاره کرد. در این تحقیق برای افزایش کارایی ترانسفکشن و همچنین هدایت این ترکیبات به ارگان هدف، لیپوزومهای کاتیونی حاوی نانوذره مغناطیسی تهیه گردید. این نوع لیپوزومها با قرار دادن نانوذره مغناطیسی داخل لیپوزوم های کاتیونی تهیه شدند. و از یک میدان مغناطیسی خارجی برای هدایت آنها به ارگان هدف و تجمع آن برروی دیواره سلولی استفاده گردید. استفاده از غلظت های بالای مگنت باعث افزایش سایز cls/pdna می-شود. کارایی ترانسفکشن در سلولهای cho با استفاده از ژن گزارشگر لوسیفراز مورد بررسی قرارگرفت. از طرفی استفاده از گزارشگرهای زیستی به دلیل مزیت هایی مانند غیر تهاجمی بودن آنهادر تصویر برداری از داخل بدن موجودزنده مورد استفاده قرار می گیرند. رایج ترین این گزارشگرها ژن لوسیفراز می باشد که نور سبز-زرد تولید می کند. از طرفی لوسیفراز مولد نور قرمز به دلیل اینکه قابلیت عبور از بافت را دارد می تواند به عنوان یک گزارشگر حساس در سیستمهای invivo imaging مورد استفاده قرار بگیرد. در این مطالعه با استفاده از روش fdel لیپوزومهای کاتیونی (cls) و لیپوزوم های کاتیونی حاوی نانوذره ی مغناطیسی (mcls) آماده سازی شدند. جهت تولید لوسیفراز مولد نور قرمز موتانت مورد نظر در وکتور pgl3 که حاوی لوسیفراز طبیعی می باشد تعیین گردید. بارسطحی و اندازه ی (cls, mcls, cls/ pdna, mcls/ pdna) مورد آنالیز قرارگرفت و کارایی ترانسفکشن این ترکیبات بررسی شد.

پروتئین های لومینسانس، ابزارهای ارزشمندی با کاربردهای فراوان می باشند. تحقیقات مولکولی روی دو گروه پروتئین های بیولومینست، لوسیفرازها و فتوپروتئین ها متمرکز شده است و از بین فتوپروتئین های بیولومینست، خانواده کلنترات بیشترین توجه را به خود جلب نموده است. علاوه بر این خانواده، فتوپروتئین های گروه کتنوفور نیز در حال بررسی است. اخیرا ژن فتوپروتئین نمیوپسین از گونه نمیوپسیس لیدی جدا شده است. در این تحقیق، جهت شناخت بیشتر عملکرد فتوپروتئین نمیوپسین دو جهش n105w با توجه به تریاد کاتالیک his16, tyr82, trp86 در اطراف حلقه اول در موقعیت کربن 6 و جهش s128g با در نظر گرفتن اهمیت شبکه پیوند هیدروژنی در اطراف حلقه 2 کلنترازین در فتوپروتئین های کلنترات، انتخاب شدند. موتانت n105w هیچ گونه فعالیتی از خود نشان نمی دهد و این در حالی است که موتانت s128g در مقایسه با فتوپروتئین طبیعی کاهش چشم گیری در فعالیت نشان می دهد. برای پی بردن به عامل موثر بر این تغییرات، شبیه سازی دینامیک مولکولی استفاده و نتایج حاصل با نتایج به دست آمده از شبیه سازی اکورین های سمی سنتتیک مقایسه شد. نتایج نشان می دهد که کاهش فعالیت در موتانت s128g می تواند مربوط به تغییرات حرکات ساختاری کلنترازین و ناحیه حفره و نیز تغییر در میانکنش لیگاند و پروتئین باشد. با توجه به نتایج حاصل می توان اینگونه بیان کرد که خواص دینامیک ساختاری پروتئین و لیگاند، نقش مهمی در فعالیت فتو پروتئین ها بازی می کند و خصوصیات نشر نوری از پارامتر مختلفی تاثیر می پذیرند.

ژن درمانی نگرش نوین در درمان است که هدف آن اصلاح ژن های معیوب یا بیان درون سلولی پروتئین های درمانگر می باشد. با وجودی که در انتقال ژن به کمک ویروس ها موفقیت های نسبی به دست آمده است ولی همچنان این گونه روش ها با محدودیت هایی از جمله ظرفیت پایین برای ماده ی ژنتیکی، ایمنی زائی وسمیت مواجه هستند که باید برطرف شوند. روش جایگزین برای انتقال ژن استفاده از سیستم های غیر ویروسی است. لیپیدهای کاتیونی، پلیمرهای کاتیونی و پروتئین و پپتیدهای کاتیونی از جمله شناخته شده ترین سیستم های غیر ویروسی به شمار می روند. علی رغم کارایی کمتر ترانسفکشن در این گونه سیستم ها نسبت به سیستم های ویروسی، به دلیل سمیت پائین تر بسیار مورد توجه می باشند. در پروژه ی حاضر تمرکز بر روی ساخت دو نوع حامل غیر ویروسی جدید بر پایه ی پلیمر و پپتید کاتیونی قرار گرفت. از آنجاکه پلیمر های کاتیونی ستاره ای شکل به دلیل ساختار مولکولی و انعطاف پذیری نسبی به عنوان سیستم های ناقل ژن مورد توجه می باشند، ساخت مشتق ستاره ای سه شاخه از پلی گلوتامیک اسید، در دستور کار قرار داده شد و ویژگی های آن در انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که این پلیمر پس از اتصال با dna، نانوذراتی با میانگین اندازه ی 230 نانومتر ایجاد می کند. همچنین بر روی سلول های cho سمیت قابل ملاحظه ای نداشت. بیان ژن توسط این نانوذرات به کمک لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که این سیستم قادر به انتقال ژن به سلول های cho می باشد و به دلیل زیست تخریب پذیری و سمیت پایین این پلیمر پتانسیل استفاده به عنوان سیستم انتقال ژن را دارا می باشد به ویژه اگر اصلاحاتی جهت بهبود رهایش از اندوزوم روی آن انجام گیرد. از سوی دیگر یک فیوژن پپتید چند دمینی نوترکیب نیز طراحی و به کمک روش های مهندسی ژنتیک تهیه شد. فیوژن پپتید شامل دو تکرار از پپتید کوتاه شده ی هیستون 1h جهت اتصال به dna پلاسمیدی، پپتید فیوزوژنیک جهت خروج از غشاء اندوزوم و سیگنال هدف برای انتقال به هسته می باشد. نتایج به دست آمده نشان دادند که پپتید حاضر به صورت موثری با dna پلاسمیدی اتصال برقرار کرده و نانوذراتی با میانگین اندازه ی ذره ای 200 نانومتر ایجاد می کند. همچنین مشخص شد که پپتید فیوزوژنیک استفاده شده در ساختار این پپتید، در phاندوزومی قادر به نفوذ به غشاء اندوزوم می باشد. به طور کلی بازده ترانسفکشن حامل پپتیدی نشان داد که این پپتید نویدی به عنوان ناقل ژن غیر ویروسی موثر و غیر سمی به شمار می رود.

امروزه رژیم غذایی نامناسب تاثیرات بسیار نامطلوبی را بر زندگی انسان گذاشته است. از جمله این اختلالات می توان به چاقی و سرطان اشاره کرد که به عنوان معضل قرن حاضر از آن یاد می شود. مواد غذایی حاوی پروبیوتیک ها از نوع غذاهای فراسودمند می باشند. پروبیوتیک ها علاوه بر کمک به گوارش مولکول های پیچیده، ترکیباتی مانند ویتامین ها و آنتی بیوتیک های مختلف را تولید می کنند که برای بدن مفید می باشند. لینولئیک اسید مزدوج، ایزومر فضایی و هندسی لینولئیک اسید، امروزه به علت خواص ویژه از جمله خاصیت ضد سرطانی، ضد التهاب و ضد چاقی با دخالت در متابولیسم چربی ها، تقویت کننده سامانه ایمنی امروزه بسیار مورد توجه قرار گرفته است. از این رو در این مطالعه به بررسی تولید لینولئیک اسید مزدوج توسط سویه های پروبیوتیکی پرداخته شد. در ابتدا، اثر روغن آفتابگردان و لینولئیک اسید بر رشد سه سویه استاندارد پروبیوتیک مطالعه شد. توانایی 5 پروبیوتیک مورد نظر به دو شکل سلول های در حال رشد و سلول های در حال استراحت برای تولید لینولئیک اسید مزدوج مورد بررسی قرار گرفت. سپس تاثیر تیمار سلول های در حال رشد با لینولئیک اسید و استفاده از توده سلولی به دست آمده از آن ها برای تولید لینولئیک اسید مزدوج ، نقش آنزیم لیپاز در حضور منابع تری گلیسریدی لینولئیک اسید ، تاثیر غلظت و نوع سوبسترا در لینولئیک اسید مزدوج تولید شده نیز مورد بررسی واقع شد. با استفاده از طراحی آزمایش به روش تاگوچی بهینه سازی فاکتورهای دمای گرماگذاری، ph بافر فسفات پتاسیم m1/0، میزان تلقیح توده سلولی مرطوب در محیط تولید، میزان توئین 80 به عنوان امولسیفایر، غلظت سوبسترا، زمان گرماگذاری و تاثیر اکسیژن بر تولید ایزومرهای لینولئیک اسید مزدوج انجام شد. بیشترین میزان تولید ایزومرهای لینولئیک اسید مزدوج با استفاده از 12% توده سلولی مرطوب lactobacillus plantarum atcc 8014 از 008/0 روغن آفتابگردان، در بافر فسفات پتاسیم m1/0 با 5/6 ph تحت شرایط عدم حضور اکسیژن، در دمای گرماگذاری c°37 به مدت 72 ساعت بوده است. همچنین با استفاده از توالی گزارش شده در genbank، طراحی پرایمر برای ژن لینولئات ایزومراز سویه lactobacillus plantarum atcc 8014 صورت گرفت و با انجام pcr میزان شباهت میان توالی ژن لینولئات ایزومراز این سویه با ژن لینولئات ایزومراز سایر سویه های مولد لینولئیک اسید مزدوج مورد بررسی، مشخص گردید.

فتوپروتئینها گروهی از پروتئین های بیولومینسانس می باشند که دارای اهمیت و کاربردهای فراوانی در علوم مختلف هستند. از این رو تحقیقات گسترده ای برای درک مکانیسم این پروتئینها جهت بهینه کردن فعالیت آنها در حال انجام است. در این تحقیق، جهت شناخت بیشتر عملکرد فتوپروتئین نمیوپسین دو جهش leu36his و phe186his انتخاب شدند. از این گروه می توان به کلنترات، کتنفور و شعاعیان اشاره کرد که دارای تشابهات ساختاری بوده و به گروه فتوپروتئین های وابسته به کلسیم تعلق دارند. در این تحقیق برای بررسی مکانیسم نورزایی فتوپروتئین نمیوپسین جهش های leu36his و trp86his طراحی شد. نتایج نشان دادند که این جهش ها باعث از دست رفتن فعالیت می شود. نتایج cd و مطالعات فلورسانس نشان داد که موتانت های نمیوپسین دارای ساختار فشرده بیشتر و مارپیچ های آلفای کمتری در مقایسه با پروتئین طبیعی می باشد. شبیه سازی دینامیک مولکولی برای نمیوپسین های طبیعی و جهش یافته انجام شد و نتایج حاصل با داده های به دست آمده از شبیه سازی اکورین های طبیعی و موتانت phe149ser مقایسه شد. میزان rmsd و جابجایی در موتانت phe186his بیشتر از موتانت leu36his می باشد. از طرف دیگر، برای نشان دادن الگوی تحرک ساختاری پروتئین های موتانت و طبیعی میزان نوسانات ریشه میانگین مربعات (rmsf) برای هر ریشه محاسبه شد. نتیج نشان داد که ریشه های 1-13، 56-72، 77-96 و 137-141 از موتانت phe186his دارای بیشترین انعطاف پذیری بوده که اثر گلوبال این جهش را نشان می دهد، در حالی که اثر جهش leu36his بر ساختار به صورت موضعی می باشد. بعلاوه، نتایج نشان می دهد که تغییرات ساختاری در ناحیه گروه پراکسید موجود در پاکت اتصالی که نقش مهمی در فرآیند بیولومینسانس ایفا می کند، ممکن است باعث جلوگیری از تخریب گروه پراکسیدی شده و مانع از فرآیند بیولومینسانسی می شود. این نتایج می توانند در درک مکانیسم نورزایی در فتوپروتئین نمیوپسین استفاده شود.

چکیده: آنزیم لوسیفراز عامل اصلی پدیده بیولومینسانس یا نشر نور توسط موجودات زنده است. بیولومینسانس به فرآیند تبدیل انرژی شیمیایی به نور در سیستمهای زیستی گفته میشود و به دو جزء اصلی یعنی آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین بستگی دارد. این فرایند در دسته وسیعی از جانداران آبزی و خشکیزی مشاهده و گزارش شده است. آنزیمهای درگیر در این فرایند با نام کلی لوسیفراز نامگذاری شده اند. واکنش آنزیمها عموماً منجر به تولید نور سبز- زرد می شود . به دلیل کاربرد فراوان لوسیفراز حشره شبتاب، بیشتر مطالعات بر روی این آنزیم صورت گرفته است. این آنزیم با استفاده از atp و mg2+ ،o با انجام عمل اکسیداتیو، دکربوکسیلاسیون بر روی سوبسترای –d لوسیفرین، نور سبز- زرد و نیز آدنوزین مونوفسفات co2 (amp) اکسی لوسیفرین و پیروفسفات (ppi) تولید می کند . ژن لوسیفراز به عنوان ژن گزارشگر بسیار حساس، کاربرد فراوان دارد. به طور معمول، تولید لوسیفراز نوترکیب عمدتاً به سیستمهای میکروبی وابسته است. لوسیفراز نوترکیبی که در این سیستم ها بیان میشود، به دلیل ماهیت پروکاریوتی سیستم بیانی باکتریها، فاقد خصوصیات مطلوب آنزیمی و پایداری مناسب می باشد، اما فرآیندهایی نظیر تشکیل باندهای دی سولفیدی ، تاخوردگی و گلیکوزیلاسیون در سیستمهای بیان گیاهی به طرز صحیح صورت می گیرد. همچنین فرمهای تجاری موجود این آنزیم، بسیار گرانقیمت بوده و استفاده از آنها مقرون به صرفه نیست. امروزه ژنهای گزارشگر نقش بسیار مهمی در مهندسی ژنتیک دارد. برای بهینه سازی ژن لوسیفراز جهت بیان مناسب در گیاه سعی در حذف و تغییر چندین نوکلئوتید در ژن خواهد شد. بدین منظور پرایمرهای تخصصی با استفاده از نرم افزارهایgene runner , oligo analyzer و genious طراحی شده و برای افزایش بیان ژن در گیاه تمهیداتی نظیر اضافه کردن توالی کزاک همچنین حذف توالی پراکسی زومی از انتهای ژن و ... در نظر گرفته شد . در این پژوهش ژن لوسیفراز که بر اساس ترجیح کدونی برای سلولهای گیاهی به صورت codon optimize شده توسط شرکت promega سنتز شده بود بعد از اعمال تغییرات به وسیله پرایمرها با تکثیر از طریق pcr با آغازگرهای اختصاصی در ناقل ویروس کلون شد. و سپس با روش saat به سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 منتقل شدند. برای تهیه سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 ابتدا بذرها شستشو داده شد و سپس در محیط ms بدون هورمون کاشته شد بعد از گرفتن گیاه کامل برگها به محیط القا کالوس منتقل شدند سپس کالوسها را به محیط مایع ls جهت جدا شدن سلولهای کالوس از یکدیگر منتقل شد. ناقل کلون شده را با استفاده از روشهای ذکر شده به این سلولها منتقل نموده و سپس با استفاده از دستگاه لومینومتر مقدار فعالیت این آنزیم در گیاه به صورت in vivo اندازه گیری شد.

ژن درمانی نگرش نوین در درمان است که هدف آن اصلاح ژن های معیوب یا بیان درون سلولی پروتئین های درمانگر می باشد. یکی از کاربردهای مهم ژن درمانی در درمان سرطان می باشد. دو مشکل عمده ژن درمانی سرطان، عدم وجود سیستم مناسب برای انتقال ژن به درون سلول و نبودن روش مناسب و کارآمد برای محدود کردن بیان ژن در سلول های سرطانی و عدم تاثیر بر سلول های سالم می باشد. به همین سبب بخش عمده ای از تحقیقات در زمینه ی ژن درمانی، به مطالعه و تحقیق بر روی سیستم های گوناگون انتقال ژن و سیستم های تنظیم بیان ژن معطوف شده است. استفاده از لیپوزوم های کاتیونی به عنوان یک سیستم انتقال ژن غیر ویروسی امروزه زیاد مورد توجه قرار گرفته است. در پروژه ی حاضر نانولیپوزوم های کاتیونی با هدف بررسی تاثیر تنوع لیپیدی بر روی کارایی انتقال ژن به سلول های یوکاریوتی ساخته شد. به این منظور ابتدا لیپوزوم های کاتیونی دو، سه چهار و پنج ترکیبی با استفاده از لیپید کاتیونی ddab و لیپیدهای خنثی dope، dspc، dppc و کلسترول ساخته شدند. اندازه، پتانسیل زتا و توانایی این نانو لیپوزوم ها در اتصال به dna پلاسمیدی بررسی شد. بهترین نانو لیپوزوم ها برای انتقال ژن به سلول hek293 انتخاب شد. میزان سمیت و توانایی حفظ dna پلاسمیدی توسط نانولیپوزوم ها در حضور آنزیم dnasei و سرم سنجیده شد. نتایج نشان داد که تنوع لیپیدی نقش مهمی در ویژگی های فیزیکو شیمیایی و کارایی انتقال ژن توسط نانولیپوزوم ها دارد. در قسمت دوم پروژه به منظور تنظیم بیان ژن در سلول های سالم و سرطانی از سیستم تنظیم بیان ژن در مرحله بعد از رونویسی توسط mirna ها استفاده شد. برای بررسی کارایی mirna داخل سلولی بر روی بیان ژن انتقالی در سلول های mcf10a سالم و mcf7 سرطانی از ژن لوسیفراز به عنوان ژن گزارشگر و از توالی هدف mir-145 به عنوان تنظیم کننده بیان ژن استفاده شد. نتایج نشان داد mir-145 داخل سلولی تا حد زیادی بیان ژن لوسیفراز را در سلول های سالم mcf10a نسبت به سلول های سرطانی mcf7 کاهش می دهد.

اینوزیتول تری فسفات ip3)) یک پیام بر ثانویه است که با هیدرولیز فسفاتیدیل اینوزیتول 4،5- بیس فسفات توسط فسفولیپاز-c تولید می شود. ip3 نقش مهمی در آزاد سازی کلسیم از ذخایر سلولی دارد. خروج کلسیم داخل سلولی از طریق اتصال ip3به پروتئین گیرنده غشایی ip3 و باز شدن کانال های روی غشا انجام می شود. اختلال در این مسیر، منجر به اختلالات متابولیسمی و به دنبال آن بسیاری از بیماری های متابولیکی می شود. اهمیت متابولیکی این مولکول، ساخت یک سنسور زیستی را جهت شناسایی آن مورد توجه قرار می دهد. یکی از روش های جدید بررسی عملکرد پروتئین ها و ترکیبات درون سلول، استراتژی مکمل سازی قطعات پروتئین های گزارشگر(protein-fragment complementation strategy) است. برای سنجش مولکول های زیستی کوچک، با تعبیه کردن دمین های حامل جایگاه اتصال مولکول مورد نظر درون ساختار پروتئین های گزارشگر، سنسورهای زیستی ایجاد می شود. این سنسورهای زیستی قابلیت ردیابی ترکیبات سلول را داشته و با میانکنش مولکول هدف با جایگاه اتصال خود، سنسور نشر نور خواهد داشت. سنسور طراحی شده در این رساله متشکل از دمین هسته اتصال به ip3 بوده که در بین قطعات جدا شده لوسیفراز قرار گرفته است. اتصال ip3 به جایگاه خود منجر به تغییرات کانفورماسیونی شده و باعث بازآرایی پروتئین گزارشگر لوسیفراز و متعاقب آن نشر نور می شود. سازه ساخته شده به داخل سلول hek293t انتقال یافته و در حضور ip3 میزان فعالیت آن بررسی شد. نتایج نشان داد که اتصال لیگاند منجر به نشر لومینسانس می شود. اگرچه سنسور ساخته شده دارای فعالیت پایه است اما نسبت سیگنال در حضور ip3 به طور قابل توجهی از فعالیت پایه آن در عدم حضور ip3 بالاتر است. سیگنال در سیستم in vitro حدود 11 برابر و در حضور القاکننده های رهایش ip3 در سلول زنده (living cell) حدود 8 برابر قوی تر از فعالیت پایه است.

آپوپتوز (مرگ برنامه ریزی شده سلول) یک مولفه حیاتی در فرآیند های مختلفی همچون تغییرات طبیعی سلول، تکوین صحیح و کارکرد سیستم ایمنی، آتروفی وابسته به هورمون، تکوین جنینی و مرگ سلولی القاء شده با مواد شیمیایی می باشد و از طریق دو مسیر داخلی و خارجی آغاز می گردد. در مسیر داخلی محرک های مختلفی باعث رهایی سیتوکروم c از میتوکندری می شود. سپس سیتوکروم c به apaf-1 متصل و آن را به همراه پروکاسپاز9 فعال می سازد و کمپلکس آپوپتوزوم را تشکیل می دهد.اتصال سیتوکروم c تغییراتی را در ساختمان فضایی apaf-1 القاء می سازد و آن را در وضعیتی قرار می دهد که از حالت خودمهاری به فرم فعال تبدیل می شود. در این مطالعه سعی بر شناخت مکانیسم مولکولی بوده است که طی آن مولکول های apaf-1 به حالت فعال تبدیل می شوند. بدین منظور با استفاده از pcr تغییر سریع یک جهش نقطه ای در ژن کلون شده apaf-1 وارد گردید، به صورتی که یک پل نمکی که رابط دو دمین مختلف مولکول apaf-1 است تخریب گردد. طبق داده های حاصل از کریستالوگرافی پرتو x شکست این پل نمکی برای تشکیل آپوپتوزوم ضروری است. سپس ژن جهش یافته به درون سلول های کلیه جنینی انسان (hek293) ترانسفکت گردید و با استفاده از لوسیفراز قطعه ای تشکیل کمپلکس آپوپتوزوم مورد سنجش قرار گرفت. با القای آپوپتوز در سلول های ترانسفکت شده کمپلکس آپوپتوزوم تشکیل نشد و فعالیت کاسپازها مشاهده نگردید. این مشاهدات نشان می دهد که مولکول های apaf-1 در حالت خودمهاری قفل شده اند.

سلول درمانی یکی از روش های امیدوارکننده در درمان دیابت نوع1 می باشد. یکی از مناسب ترین گزینه ها برای این منظور، سلول های پیش ساز مشتق از پوست (skp) است که پتانسیل تمایز به سلول های سازنده انسولین (ipc) را دارند. ما در این تحقیق سلول های پیش ساز پوست انسانی را در محیط برون تن جداسازی و کشت داده و آنها را در مجاورت فاکتور های رشد تمایزی مناسب به سلول انسولین ساز تمایز دادیم. بیان ژن های ویژه سلول اندوکرین بتا توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز- نسخه برداری معکوس بررسی شد. علاوه بر آن، تولید و ترشح انسولین و پپتید-c توسط روش ایمونوسیتوشیمی و الایزا مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکنیک های پروتئومیکس برای بررسی تغییرات بیان پروتئین در سلول های پیش ساز و تمایز یافته به کار گرفته شد. پس از گذشت سه هفته از کشت سلول های پیش ساز پوست در محیط تمایزی، خوشه های سلولی دیتیزون مثبت پدیدار شدند. خوشه های سلولی تمایز یافته از نظر وجود انسولین مثبت بودند و مارکرهای مربوط به سلول های بتا را بیان نمودند. خوشه های سلولی حاصله در پاسخ به تحریک گلوکز به صورت وابسته به غلظت، انسولین و پپتید-c تولید و ترشح نمودند. مشاهدات پروتئومیکس نشان داد که در روند تمایز تغییراتی در بیان 13 پروتئین با عملکرد های متفاوت ایجاد شد: عملکرد متابولیک، چاپرونی، آنتی اکسیدانی، تجزیه ای، رونویسی، سیگنالینگ. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که سلول های تمایز یافته از نظر فنوتیپ، مارکرهای سلولی و فعالیت ترشحی ماهیت سلول های بتای انسولین ساز از خود نشان می دهند. این یافته ها نشان داد که سلول های پیش ساز پوست قادرند به سلول های بتای مولد انسولین تمایز نمایند و سلول های تمایز یافته می توانند به عنوان یک کاندید جدید در سلول درمانی دیابت مد نظر قرارگیرند.

امروزه بخش عظیمی از تحقیقات پزشکی، زیست شناسی و شیمیایی به تولید یک ساختار غیر ویروسی کارآمد برای انتقال ژن اختصاص یافته است. در میان ساختارهای موجود، لیپوزوم های خنثی به دلیل داشتن ساختاری ساده و خودسامانده و در ضمن غیر سمی بودن آنها از ارزش بسزایی برخوردارند. با این وجود به دلیل کارایی پایین این ساختارها در محصورسازی dna، تا کنون در حیطه انتقال ژن توجه کمی به آنها شده است. در این رساله با استفاده از تکنیک آبگیری- آبدهی دو مرحله ای و دقت در آبدهی کنترل شده و تدریجی، برای اولین بار درصد بسیار بالایی از مولکول dna (98%) داخل یک غشاء دولایه لیپیدی خنثی، متشکل از dmpc و کلسترول محصورسازی شد. ساختار فسفولیپیدی حاصل از پایداری بسیار بالایی برخودار بود؛ به طوری که بعد از گذشت 6 ماه همچنان مولکول dna را داخل ساختار خود حفظ کرده و از آن در مقابل آنزیم-های تخریب کننده محافظت نمود. این وزیکول های دولایه فسفولیپیدی که اندازه ای بین 150-100 نانومتر داشتند؛ با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مورد مطالعه قرار گرفتند. در تصاویر میکروسکوپی مشخص شد که این لیپوزوم ها همانند ویروس ها توانایی بالایی در ادغام غشائی از خود نشان می دهند. این سامانه لیپوزومی خنثی با انتقال dna و rna به سلول های یوکارتی cho تولید کننده پایدار gfp، توانست درصدی از ژن gfp را خاموش سازد. هر چند که کارایی انتقال پایین تر از لیپوزوم کاتیونی تجاری (لیپوفکتامین) بود ولی با توجه به مزایای منحصر به فرد این حامل ها می توان امید داشت که با بهینه سازی شرایط، در آینده ای نه چندان دور جایگاه ویژه ای در سیستم های انتقالی بیابند.

آنزیم تلومراز با حفظ و نگه داری انتهای کروموزوم ها نقش مهمی را در سرطان زایی و نامیرایی سلولی ایفا می کند. مطالعات نشان داده است که بیان زیر واحد پروتئینی تلومراز ، htert ، در بیش تر سرطان ها افزایش می یابد . بررسی ناحیه ی پروموتری htert نواحی اتصالی متعددی را برای فاکتور های فعال کننده و سرکوب کننده نشان می دهد . در این رابطه tgf?1 به عنوان یکی از مهم ترین مسیر های مهار کننده ی بیان ژن htert مطرح می شود. از طرف دیگر از میان ترکیبات مهار کننده ی تلومراز می توان به کورکومین اشاره کرد که جزو ساختاری اصلی پودر زردچوبه است و از ساقه ی زیرزمینی گیاه curcuma longa استخراج می شود و به طور انتخابی باعث القای مرگ سلول های سرطانی از طریق آپوپتوز می شود . از آن-جایی که حلالیت کورکومین در محیط های آبی کم می باشد استفاده از یک نانو حامل پلیمری بر این مشکل غلبه کرده و باعث بهبود خصوصیات ضد سرطانی آن در محیط های in vivo و in vitro می شود . از این رو با توجه به نقش 1?tgf به عنوان یکی از مهار کننده های اصلی ژن htert در رده ی سلولی سرطانی کبد ، huh7 ، اثر نانوکورکومین پلیمری در القای مسیر سیگنال دهی tgf?1 در این سلول ها مورد بررسی قرار گرفت . بنابراین آزمون mtt برای ارزیابی قابلیت بقای سلول های huh7 تیمار شده با نانوکورکومین در زمان های 24، 48 و 72 ساعت انجام شد . هم چنین بررسی تغییرات بیان ژن های مسیر tgf?1 ( tgf?1 ، smad3 و smad7 ) ، ژن e2f1 ( میانجی گر عملکرد مهاری tgf?1 ) و ژن htert از طریق rt-pcr در سلول های huh7 تیمار شده با غلظت µm 15 نانوکورکومین ، حاکی از القای مسیر tgf?1 ( p<0.001 ) و در نتیجه کاهش بیان ژن htert ( p<0.001 ) در طی 72 ساعت پس از تیمار با نانوکورکومین بود . از طرف دیگر نتایج ترنسفکشن سلول های huh7 با وکتور pgl4.14 حاوی ناحیه ی اثر مسیر tgf?1 در پروموتر ژن htert در شرایط تیمار با غلظت های 15 و 20 میکرومولار از نانوکورکومین ، نشان دهنده ی کاهش فعالیت لوسیفرازی این وکتور نسبت به حالت کنترل بود ( p<0.0001 ). نتایج این تحقیق نشانگر نقش نانوکورکومین پلیمری در کاهش بیان ژن تلومراز از طریق القای مسیر tgf?1 در سلول های huh7 می باشد ترکیبی موثر ، که این امر نشانگر قابلیت نانوکورکومین پلیمری به عنوان ترکیبی موثر در راستای درمان سرطان می باشد .

آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول یک نوع از مرگ سلولی می باشد که موجودات چند سلولی جهت حذف سلول های نا مناسب از آن استفاده می نمایند. نکته مهم در خلال حذف این نوع سلول ها این است که فرایند آپوپتوز به حدی کنترل شده و ایمن باشد که به ساختارهای مجاور هیچ نوع آسیبی وارد نشود. در این مطالعه با استفاده از دیدگاه protein complementation assay و تکنولوژی گزارشگر های دو بخشی لوسیفراز یک روش سلولی جدید جهت سنجش آپوپتوز در سطح تشکیل کمپلکس آپوپتوزوم و اولیگو مریزه شدن مولکول apaf1 در مراحل بسیار ابتدائی آپوپتوز ارائه گردید. در این روش ابتدا قطعه آمین آنزیم لوسیفراز ( اسید آمینه های 1-416) به سمت آمین مولکول apaf1 متصل گردید. سپس قطعه کربوکسی آنزیم لوسیفراز (اسید آمینه های 395-550 ) به سمت آمین یک apaf1 دیگر متصل گردید. سلول های ترانسفکت شده با این دو سازه نوترکیب تحت القاء آپوپتوز با داروی doxorubicin در غلظت 0.5میکرو مولار قرار گرفتند. آنالیز های انجام شده جهت سنجش فعالیت لوسیفراز افزایش 15 برابری را تنها چهار ساعت پس از القاء آپوپتوز نشان می داد و این افزایش فعالیت در ظرف مدت 10 ساعت پس از القاء آپوپتوز به 155 برابر در مقا یسه با حالت کنترل می رسد. مقایسه نتایج حاصل از این روش با روش مبتنی بر استفاده از سوبسترای فلوروسنت که کاسپاز های فعال شده 3 و 7 را اندازه کیری می کند نشان می داد که از نظر زمانی روش ارائه شده 5 ساعت زودتر توان اندازه گیری آپوپتوز را دارا می باشد. همچنین نسبت افزایش سیگنال مشاهده شده در دو سیستم نشان دهنده بهبود وضعیت signal/noise در سیستم لوسیفراز دو بخشی می باشد. این سیستم گزارشگر می تواند به صورت موثری جهت بررسی پتانسیل شیمی درمانی ترکیبات متفاوت و همچنین مطالعات غلظتی و زمانی این ترکیبات مورد استفاده قرار گیرد

در بیماری als نیز بیماران مبتلا دارای تجمعات پروتئینی در جسم سلولی و آکسونهای نورونهای حرکتی بافت عصبی خود می باشند که بطور عمده متشکل از آنزیم سوپراکسید دیسموتاز 1 (sod1) است. جهش در ژن sod1 در 20% از موارد familial als (fals) مشاهده می شود و به عنوان یک عامل مهم در ایجاد این بیماری شناخته می شود. مکانیزم بیماری زایی تجمعات sod1در بیماری fals اگر چه هنوز به طور کامل مشخص نیست اما تغییر در خصوصیات غشا، ازجمله نفوذ پذیری و به همریختگی یکپارچگی (خصوصا در حضور حدواسط های اولیگومری) آن به عنوان یک مکانیسم مطرح باشد.

فرآیند تولید آدنوزین تری فسفات (atp) در موجودات زنده از اهمیت ویژه ای برخوردار است. تحقیقات مختلف نشان داده است که بررسی این فرآیند به صورت کمی و در قالب مدل های ریاضی در مراجع به طور مختصر ارائه شده است. در سال های اخیر بر اساس معادلات ترمودینامیک غیرتعادلی و با استفاده از نظریه شیمی اسمزی، مدل ترمودینامیکی برای محاسبه بازده فرآیند فسفریلاسیون اکسایشی و اتلاف انرژی برای میتوکندری سلول های جانوری ارائه شده است. در این پژوهش با بازبینی تحقیقات انجام شده روی میتوکندری سلول های جانوری، اصلاحاتی در محاسبات مربوط به میتوکندری انجام شد. همچنین با توجه به شباهت فرآیند فسفریلاسیون اکسایشی در میکروب ها با سلول های جانوری، به بررسی فرآیند تولید آدنوزین تری فسفات با استفاده از مدل ترمودینامیکی غیرتعادلی ارائه-شده برای باکتری ها، پرداخته شد. با استفاده از این مدل، نرخ اتلاف انرژی، نسبت p/o و بازده فرآیند فسفریلاسیون اکسایشی برای باکتری اشرشیاکلی و ولینلاساکسینوجینس در شرایط مختلف پیوسته هوازی و بی هوازی محاسبه شد و با داده های تجربی حاصل از مراجع مقایسه شد و ملاحظه گردید که این مدل ترمودینامیکی با داده های تجربی انطباق قابل قبولی دارد. برای باکتری اشرشیاکلی در شرایط آزمایشگاهی ناپیوسته نیز نسبت p/o به دست آمد و مشاهده گردید که نسبت p/o در شرایط آزمایشگاهی ناپیوسته، به طور تقریبی با نسبت p/o در رشد پیوسته باکتری اشرشیاکلی، با شرایط مشابه برابر است. کلمات کلیدی: ترمودینامیک غیرتعادلی، فسفریلاسیون اکسایشی، اشرشیاکلی، ولینلا ساکسینو-جینس، آدنوزین تری فسفات

آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول یک نوع از مرگ سلولی می باشد که موجودات چند سلولی جهت حذف سلول های نا مناسب از آن استفاده می نمایند. نکته مهم در خلال حذف این نوع سلول ها این است که فرایند آپوپتوز به حدی کنترل شده و ایمن باشد که به ساختارهای مجاور هیچ نوع آسیبی وارد نشود. در این مطالعه با استفاده از دیدگاه protein complementation assay و تکنولوژی گزارشگر های دو بخشی لوسیفراز نقش دمین wd-40 از پروتئین apaf-1 بررسی شد. در این روش با استفاده از دو سازه که یکی حاوی قطعه آمین آنزیم لوسیفراز ( اسید آمینه های 1-416) متصل شده به سمت آمین مولکول apaf1 و دیگری حاوی قطعه کربوکسی آنزیم لوسیفراز (اسید آمینه های 395-550 ) متصل شده به سمت آمین apaf1 بود، نقش دمین wd-40 مورد بررسی قرار گرفت.برای این بررسی دمین wd-40 با یک جهش نقطه ایی و تبدیل رمز یک آمینواسید به رمز پایان از پروتئین apaf-1 حذف شد.سلول های ترانسفکت شده با این دو سازه نوترکیب تحت القاء آپوپتوز با داروی doxorubicin در غلظت 1 میکرو مولار قرار گرفتند. آنالیز های انجام شده جهت سنجش فعالیت لوسیفراز افزایش 650 برابری را 17 ساعت پس از القاء آپوپتوز نشان می داد و با وجو این افزایش فعالیت کاسپازها تقریبا بدون تغییر ماند. مقایسه نتایج حاصل از این بررسی با نتایج حاصل از کارهای گذشته نشان داد حذف دمین wd-40 سبب حساسیت بسیار بیشتر پروتئن apaf-1 به داروهای ضد سرطان و تشکیل کمپلکس آپاپتوزوم می شود، درضمن این کمپلکس توانایی فعال کردن کاسپازهای سلول را دارد.

یکی از دلایل عمده¬¬ی مقاومت فوق¬العاده¬ بالای سیست آرتمیا به استرس در شرایط چالش بر¬انگیزی نظیر خشکی شدید، بی¬آبی، فقدان اکسیژن طولانی مدت، درجه حرارت¬های بالا و دوزهای بالای پرتو فرابنفش، سنتز منظم پروتئین آرتمین (یکی از اعضای فراخانواده¬ی فریتین) است. پیش از این، cdna¬ی آرتمین از جنین¬ سیت آرتمیا اورمیانای دریاچه¬ی¬ ارومیه جداسازی و درون وکتور pet28a به¬ منظور تولید سلول¬های e. coli نوترکیب کلون و بیان شد، و مشخص شد که می¬تواند به ¬عنوان یک چپرون کارآمد در شرایط in vitro عمل کند. به¬علاوه، نشان داده شد که بیان آرتمین در e. coli مقاومتی دمایی را به این سلول¬ها اعطا کرده و حیات سلول¬ها در برابر دماهای کشنده را بهبود می¬بخشد که احتمالا به ویژگی ضد تجمعی آن در شرایط in vivo باز می¬گردد. هرچند که اطلاعات کمی در مورد عملکرد آرتمین در سلول¬های زنده در دسترس می¬باشد. در این مطالعه، با توجه به نقش ضداسترسی پروتئین آرتمین، اثر محافظتی قابل توجه آرتمین تحت شرایط استرسی مختلف در شرایط in vivo بررسی شد. همچنین به¬منظور بررسی مستقیم فعالیت چپرونی، از ژن گزارشگر لوسیفراز به¬عنوان سوبسترای مدل استفاده شد. سیستم بیان همزمان لوسیفراز و آرتمین معرفی شده در این مطالعه، می¬تواند به¬عنوان یک سیستم گزارشگر real time جهت بررسی فعالیت چپرونی پروتئین¬ها در شرایط in vivo به¬کار گرفته شود و یک سنجش ساده و سریع برای چپرون¬های مولکولی را فراهم کند. از این¬رو، کوترنسفرماسیون سلول¬های e. coli سویه¬ی bl21 (de3) با دو وکتور بیانی حاوی ژن¬های آرتمین و لوسیفراز انجام شد. جهت بررسی فعالیت چپرونی در شرایط in vivo، ابتدا اثر آرتمین بر میزان بقا/رشد سلول¬¬ در برابر استرس های مختلف تعیین شد. باکتری¬های ترانسفورم شده¬ی حاوی ژن آرتمین تحت تیمارهای مختلف استرس قرار گرفتند و تاثیر بیان این پروتئین بر مقاومت باکتری به استرس بررسی شد. نتایج نشان داد که سلول¬های بیان کننده¬ی موقت آرتمین، مقاومت بسیار بالایی را به استرس¬های مختلف اعمال شده نشان دادند. بنابراین، با توجه به نتایج بدست آمده می¬توان حدس زد که آرتمین به ¬طور قابل توجهی، بقای سلول¬های باکتری ترانسفرم شده¬ی تحت استرس¬های گرما، اکسیداتیو، شوری، سرما و پرتو uv را افزایش می¬دهد. ازطرفی، قابلیت آرتمین بر محافظت لوسیفراز علیه غیرفعال سازی استرسی سنجیده شد. سلول¬های کوترانسفرم شده در معرض استرس¬های مختلف قرار گرفتند. فعالیت لوسیفرازی نمونه¬ها به¬عنوان گزارشی از وضعیت درون سلولی تحت این شرایط آشکار گردید. براساس نتایج بدس آمده، فعالیت لوسیفرازی باقیمانده در سلول¬های تحت القای آرتمین، به¬طور قابل توجهی بالاتر از نمونه¬های¬ فاقد آرتمین (کنترل) بود. جالب¬تر این¬که، این عملکرد به منظور بازیابی فعالیت لوسیفرازی در شرایط in vivo ضروری است، چرا که لوسیفراز به¬ تنهایی قادر به بازیابی فعالیت از دست رفته¬ی خود به¬طور کار¬آمد نیست. این¬طور به ¬نظر می¬رسد که در شرایط in vivo، آرتمین از طیف وسیعی از سوبستراها محافظت می¬کند و به ¬طور انتخابی توالی¬های پپتیدی را شناسایی کرده و به آن¬ها متصل می¬شود. حدس ما بر این است که: آرتمین علاوه بر لوسیفراز، از سایر پروتئین¬های درون سلولی حساس به شرایط استرس نیز محافظت می¬کند. روی هم رفته، با این نتایج می¬توان حدس زد که آرتمین در شرایط استرس، متحمل برخی تغییرات کانفورماسیونی وابسته می¬شود که در نهایت تغییر هیدروفوبیسیته¬ی سطحی آن را به دنبال دارد. این تغییرات جهت اتصال آرتمین به سوبستراهای پروتئینی و عملکرد آن ضروری است.

تبدیل انرژی شیمیایی به نور توسط موجودات زنده از دیرباز توجه محققان را به خود جلب نموده است. این پدیده که به بیولومینسانس معروف است واکنشی آنزیمی می باشد که بواسطه دخالت آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می گیرد. بیشترین مطالعات در زمینه بیولومینسانس بر روی حشره شب تاب آمریکائی (photinus pyralis) انجام شده است. علی رغم کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی آنزیم لوسیفراز، چندین عامل همچون پایداری پایین لوسیفراز نسبت به حرارت و km بالا برای سوبسترای atp استفاده از آن را محدود کرده است. لوسیفراز حشره شب تاب آنزیمی پراکسیزومی می باشد که طی دو مرحله، مرحله اول با نقش لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله دوم با نقش مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود، لوسیفرین به ترکیب برانگیخته اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. در ساختار لوسیفراز اسیدآمینه ترئونین 346 تنها آمینواسید می باشد که زوایای دووجهی آن در منطقه غیر مجاز نمودار راماچانداران قرار گرفته است. وجود چنین زوایای دووجهی زنجیره اصلی در ساختار پروتئین ها که از نظر انرژیتیکی نامطلوب هستند کمیاب است و معمولاً با مناطقی از مولکول که نقش عملکردی دارند همراه می باشند. از طرفی مشخص شده است که حذف فشار از ساختار پروتئین ممکن است بر پایداری پروتئین بیافزاید. بنابراین در این پروژه برای بررسی نقش این اسیدآمینه از ورود سه اسیدآمینه گلایسین با زنجیره جانبی کوچک، والین با زنجیره جانبی شبیه ترئونین اما غیرقطبی و پرولین که باعث ایجاد شکستگی در ساختار می شود استفاده شد. ورود این اسیدآمینه ها هیچ تاثیری بر روی طیف نشری نداشت اما پایداری حرارتی برای جهش یافته های t346g و t346v در دمای 30 درجه سانتی گراد افزایش یافته بود. فعالیت ویژه به میزان تقریباً زیادی برای همه ی جهش یافته ها کاهش نشان می دهد.

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب در طی دو مرحله، مرحله اول با نقش لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله دوم با نقش مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود، لوسیفرین به ترکیب برانگیخته اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. به دلیل کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی آنزیم لوسیفراز، جهش های زیادی برای افزایش پایداری حرارتی و بهبود ویژگی های سینتیکی و ساختاری آن انجام شده است. علیرغم افزایش پایداری حرارتی در تولید این نوع جهش یافته ها مشاهده شده است که مقدار km برای هر دو سوبسترای لوسیفرین و atp تا حدودی افزایش می یابد و یا فعالیت ویژه آنزیم بطور چشمگیری کاهش پیدا می کند. از طرفی مشخص شده است که پیوند دی سولفیدی با کاهش آنتروپی حالت فولدنشده (unfold) نقش مهمی در پایداری پروتئین-های پایدار بازی می کند. تاکنون هیچ گزارشی مبنی بر حضور پیوند دی سولفیدی در گونه های حشرات شب-تاب وجود ندارد. به همین دلیل در این مطالعه به منظور افزایش پایداری آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب گونه آمریکای شمالی (فوتینوس پیرالیس) و ایجاد یک آنزیم جهش یافته با ویژگی های جدید، چهار جایگاه به منظور ایجاد چهار جهش یافته با یک پیوند دی سولفید و با تلفیق آنها دو پروتئین با دو پیوند دی سولفید ایجاد شد و سپس توسط روش جهش زایی هدفدار ژن کدکننده لوسیفراز تغییر داده شد و بعد از بیان و تخلیص شش آنزیم جهش یافته، ویژگی های سینتیکی و ساختاری آنها مورد مطالعه قرار گرفت. به علاوه یکی از موتانت ها c81-a105c به فرم ترشحی در آمد و فعالیت آن در سلولهای یوکاریوتی مور مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که پیوند دی سولفید سبب شیفت نوری به ناحیه قرمز و افزایش دمای بهینه به اندازه 15 درجه سانتی گراد در بعضی از جهش ها نسبت به نمونه وحشی شده است. همچنین مطالعات ترمودینامیک تعادلی در حضور اوره، نشاندهنده افزایش پایداری ترمودینامیکی در نمونه های حاوی جهش (افزایش 2/7 کیلوژول بر مول در میزان ?gu) می باشد. بنابراین فرم ترشحی لوسیفراز، با ویژگیهای افزایش دمای بهینه، پایداری سینتیکی و ترمودینامیکی و شیفت نوری به سمت قرمز، برای مطالعات بررسی بیان ژن و غربالگری در مقیاس زیاد مناسب می باشد

چکیده شناخته شده ترین موجود بیولومینسانس، حشره شب تاب آمریکای شمالی، photinus pyralis، می باشد. بیولومینسانس یک واکنش آنزیمی است که با واسطه آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می پذیرد. آنزیم لوسیفراز اساس گستره وسیعی از تکنیک های تشخیصی را تشکیل می دهد. نور تولیدی توسط این آنزیم یکی از حساس ترین ابزارها در تشخیص atp برای اندازه گیری آلودگی های میکروبی با حساسیت بالا، سنجش های ژن گزارشگر در بیولوژی مولکولی، ارزیابی فعالیت فسفاتازها، استفاده در تعیین توالی dna و به عنوان یک ابزار در ردیابی تاخوردگی پروتئین و فعالیت چاپرونین ها در بدن موجود زنده می باشد. با این حال، آنزیم لوسیفراز بسیار ناپایدار است و به سرعت فعالیت خود را حتی در دمای اتاق از دست می دهد. این امر منجر به از دست رفتن حساسیت و دقت کاربردهای تشخیصی آنزیم می شود. برای بهبود پایداری گرمایی آنزیم از مایعات یونی و نانو مایعات یونی مغناطیسی به عنوان افزودنی های جدید و پایدار کننده استفاده کردیم. ابتدا بیان ژن و تخلیص آنزیم لوسیفراز انجام شد. برای بررسی اثر مایعات یونی و نانو مایعات یونی مغناطیسی در پایداری آنزیم، مقایسه سینتیکی و ساختاری این آنزیم در غیاب و حضور این ترکیبات انجام شد. تمایل آنزیم [km] نسبت به سوبسترای atp در حضور همه ترکیبات استفاده شده به استثنای ترکیب [bmim][bf4] کاهش یافت. همچنین ترکیبات فوق بر روی تمایل آنزیم نسبت به سوبسترای لوسیفرین هیچ گونه تاثیری نداشتند. در مطالعه غیر فعال شدن گرمایی آنزیم در حضور ترکیبات فوق یک اثر پایدار کننده قوی برای [bmim][cl]، در حفظ فعالیت آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب و جلوگیری ازغیرفعال شدن گرمایی آن مشاهده شد. همچنین نشان داده شد که این ترکیبات به جز [bmim][bf4] دمای بهینه آنزیم را تا حدودی افزایش می دهند. مطالعات ساختاری با استفاده از فلورسانس ذاتی و دورنگ نمایی دورانی (cd) نشان دهنده تغییراتی در ساختار دوم و سوم آنزیم، در حضور این ترکیبات می باشد. در مجموع نتایج نشان می دهند که مایعات یونی سرعت غیرفعال شدن آنزیم لوسیفراز را کاهش می دهند، باعث فشردگی بیشتر ساختار دوم پروتئین شده و بنابراین ساختار فضایی آنزیم را در برابر غیرفعال شدن گرمایی حفظ می کنند.

تبدیل انرژی شیمیایی به نور توسط موجودات زنده از دیرباز توجه محققان را به خود جلب نموده است. این پدیده که به بیولومینسانس معروف است واکنشی آنزیمی می باشد که بواسطه دخالت آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می گیرد. بیشترین مطالعات در زمینه بیولومینسانس بر روی حشره شب تاب آمریکائی (photinus pyralis) انجام شده است. علی رغم کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی آنزیم لوسیفراز، چندین عامل همچون پایداری پایین لوسیفراز نسبت به حرارت و km بالا برای سوبسترای atp استفاده از آن را محدود کرده است. لوسیفراز حشره شب تاب آنزیمی پراکسیزومی می باشد که طی دو مرحله، مرحله اول با نقش لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله دوم با نقش مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود، لوسیفرین به ترکیب برانگیخته اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. در ساختار لوسیفراز اسیدآمینه ترئونین 346 تنها آمینواسید می باشد که زوایای دووجهی آن در منطقه غیر مجاز نمودار راماچانداران قرار گرفته است. وجود چنین زوایای دووجهی زنجیره اصلی در ساختار پروتئین ها که از نظر انرژیتیکی نامطلوب هستند کمیاب است و معمولاً با مناطقی از مولکول که نقش عملکردی دارند همراه می باشند. از طرفی مشخص شده است که حذف فشار از ساختار پروتئین ممکن است بر پایداری پروتئین بیافزاید. بنابراین در این پروژه برای بررسی نقش این اسیدآمینه از ورود سه اسیدآمینه گلایسین با زنجیره جانبی کوچک، والین با زنجیره جانبی شبیه ترئونین اما غیرقطبی و پرولین که باعث ایجاد شکستگی در ساختار می شود استفاده شد. ورود این اسیدآمینه ها هیچ تاثیری بر روی طیف نشری نداشت اما پایداری حرارتی برای جهش یافته های t346g و t346v در دمای 30 درجه سانتی گراد افزایش یافته بود. فعالیت ویژه به میزان تقریباً زیادی برای همه ی جهش یافته ها کاهش نشان می دهد.

تکنولوژی بیولومینسانس که در کارهای تحقیقاتی و صنعتی استفاده می شود به آنزیم لوسیفراز تکیه دارد که در حضور atp وmg2+ با اکسیداسیون سوبسترای خاص خود که به عنوان لوسیفرین شناخته می شود و تشکیل اکسی لوسیفرین باعث نشر همزمان فوتون می شود. تاکنون کارهای فراوانی برای بهبود ویژگی های ساختاری و عملکردی این آنزیم صورت گرفته است. هدف ما در این مطالعه بررسی تاثیر همزمان دو جهش پایدار کننده آنزیم لوسیفراز بود. پیوند دی سولفیدی و تغییر اسید آمینه آبگریز در معرض حلال به اسیدآمینه با بار مثبت. برای این منظور ما از جهش a296c/a326cکه باعث ایجاد پیوند دی سولفیدی و در نتیجه افزایش فعالیت ویژه و پایداری حرارتی می شود استفاده کردیم. از سوی دیگر گزارش شده که جایگزینی ایزولوسین 232 به عنوان اسید آمینه در معرض حلال یکی از عوامل پایدار کننده آنزیم لوسیفراز می باشد و از آنجایی که یکی از ویژگی های آنزیم های مقاوم به حرارت دارا بودن آرژنین فراوان بخصوص در نواحی در معرض حلال می باشد، جهش i232r انتخاب شد. بنابراین جهش های i232rو i232r/a296c/a326c در لوسیفرازگونه فوتینوس پیرالیس با روش جهش زایی هدفدار ایجاد شد و در کنار آنزیم لوسیفراز طبیعی و دارای جهش a296c/a326c مورد مطالعات ساختاری و سنتیکی قرار گرفتند. نتایج حاکی از این است که جهش i232rو i232r/a296c/a326c باعث افزایش پایداری حرارتی و پروتئازی و کاهش تمایل آنزیم به لوسیفرین وatp شده است ولی نسبت به جهش یافته a296c/a326c پایداری حرارتی کمتر می باشد که نشان دهنده افزایشی نبودن تغییرات ایجاد شده در اثر جهش ها می باشد.

لوسیفراز پروتئینی است که دارای یک دمین بزرگ در انتهای آمین و یک دمین کوچک در انتهای کربوکسیل است. آنالیزهای b-factor نشان دهنده این است که دمین انتهای کربوکسیل لوسیفراز، انعطاف پذیرتر از دمین انتهای آمین می باشد. مطالعه بر روی پروتئین های ترموفیل نشان داده است که پایداری دمائی پروتئین های ترموفیل در نتیجه استحکام ساختاری بیشتر آنها است. در ضمن ارتباط بین انعطاف پذیری، پایداری و عملکرد در اغلب پروتئین ها مبهم است. در این مطالعه جهت بررسی ارتباط بین پایداری و انعطاف پذیری در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز در دو گونه lampyris turkestanikus و photinus pyralisاز دو روش جهش زائی اشباعی و جهش زائی هدفدار استفاده شده است. در لوسیفراز گونه l.turkestanikus، از روش جهش زائی اشباعی استفاده شد و کتابخانه ایجاد شده غربالگری شد. اما کلونی های دارای پایداری دمائی قابل توجه یافت نشد و دو کلونی با افزایش جزئی در پایداری دمائی انتخاب شده و تعیین توالی شدند. کلونی های انتخابی دارای جهش های p473l و p473r بودند. آنالیز های پایداری دمائی پروتئین های خالص نشان داد که جهش یافته های p474lو p473r کمی ناپایدار شده و هر دو جهش یافته نسبت به گونه وحشی انعطاف پذیرتر شده اند.در لوسیفراز گونه p.pyralis، جهش زائی هدفدار مورد استفاده قرار گرفت و دو جهش d474k و d476n در انعطاف پذیرترین بخش لوسیفراز طراحی و ایجاد شد. آنالیز های پایداری دمائی نشان داد که جهش d476n اثر چشمگیری در پایداری ایجاد نکرده است اما جهش یافته d474k ناپایدار شده است.از طرف دیگر آنالیزهای انعطاف پذیری با استفاده از فلورسانس خاموشی و پروتئولیز محدود نشان داد که جهش یافته d474k نسبت به پروتئن اصلی انعطاف پذیرتر شده در حالیکه d476n تفاوتی محسوس پیدا نکرده است، در ضمن مطالعات فلورسانس ans و فلورسانس ذاتی نشان داد که در جهش یافته d476n تغییرات ساختاری ایجاد شده اما این تغییرات ساختاری اثر محسوسی در پایداری و انعطاف پذیری ایجاد نکرده است. بررسی های بیوانفورماتیک نشان داد که تخریب یک پل نمکی بین d474 و k445، به همراه حذف یک پیوند هیدروژنی ممکن است علت های نا پایداری دمائی جهش یافته d474k باشند.

آپوپتوزیس یا مرگ برنامه ریزی شده سلول، یک فرآیند فیزیولوژیک سلولی است که منجر به نمو فعال و طبیعی و همچنین حفظ هموستازی بافت ها می شود. آپوپتوزیس می تواند تحت تأثیر عوامل مختلف محیطی و یا داخلی رخ دهد. این تحقیق به منظور یافتن روش مناسبی جهت القای آپوپتوزیس در سلول های t- لنفوبلاست jurkat خون انجام شده است. در این پژوهش اثر میدان مغناطیسی ایستای 6 میلی تسلا و پرتو گاما با دزهای 1/5، 3 و 7/5 گری به تنهایی و به طور هم زمان، بر القای آپوپتوزیس، تغییر چرخه ی سلولی و فسفریلاسیون پروتئین های atm و e2f1 در سلول های jurkat تابش دیده مورد بررسی قرار گرفت. تابش دهی سلول های jurkat فاقد نسخه ی طبیعی ژن p53 توسط میدان مغناطیسی ایستای 6 میلی تسلا و پرتوهای گاما به تنهایی و هم زمان با هم، منجر به آپوپتوزیس گردید که توسط روش لومینومتری و فلوسایتومتری آشکارسازی شد. همچنین تابش میدان مغناطیسی ایستا و پرتوهای گاما به تنهایی و هم زمان باهم، باعث تغییر در چرخه سلولی سلول های jurkat تابش دیده شد که توسط روش فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت. روش وسترن بلات نشان داد که مقدار پروتئین های فسفریله شده ی atm و e2f1 در سلول های jurkat تابش دیده افزایش می یابد. بر اساس یافته های روش لومینومتری، 36 ساعت بعد از تابش میدان مغناطیسی 6 میلی تسلا در سلول های تابش دیده فرآیند آپوپتوزیس معنی داری (0/05>p) مشاهده گردید و 48 ساعت بعد از میدان دهی به بیش ترین مقدار خود یعنی 35/5 درصد نسبت به نمونه کنترل رسید. در سلول های پرتودهی شده با دز 1/5 و 3 گری، آپوپتوزیس 18 ساعت پس از تابش پرتو مشاهده شد، در صورتی که در سلول های پرتودهی شده با دز 7/5 گری، فرآیند سریعتر (12 ساعت پس از تابش پرتو) مشاهده گردید. میزان آپوپتوزیس در تمامی سلول های تابش دیده، 48 ساعت پس از پرتودهی به بیش ترین مقدار خود رسید (0/05>p). در سلول های تیمار شده با میدان مغناطیسی و پرتو به طور هم زمان، 12 ساعت پس از پرتودهی، آپوپتوزیس مشاهده شد (0/05>p). پیشنهاد می شود، تابش میدان مغناطیسی ایستای 6 میلی تسلا و پرتو گاما با دزهای ذکر شده، باعث آسیب هایی در مولکول dna شده و این آسیب ها به نوبه ی خود، باعث افزایش پروتئین های فسفریله شده ی atm و e2f1 می شوند. افزایش این پروتئین ها نیز منجر به القای آپوپتوزیس و تغییر در چرخه ی سلولی سلول های jurkat تابش دیده می گردد.

آنزیم بازیافت کننده لوسیفرین (lre) در بازیافت d-luciferin به صورت in vitro مشارکت می نماید و سبب افزایش شدت و زمان نشر نور لوسیفراز حشره می شود. دُمین های اتصالی به لوسیفرین i و ii به عنوان نواحی بالقوه جایگاه اتصالی لوسیفرین شناخته شده اند. در این تحقیق برای نخستین بار آمینواسیدهای t69، g75 و k77 موجود در دُمین اتصالی به لوسیفرین i مربوط به t-lre از گونه l.turkestanicus از طریق جهش زایی هدفمند جایگزین گردیدند. در مقایسه با دیگر جهش یافته ها، t69r بازه زمانی نشر نور را طولانی تر می نماید و همچنین سبب افزایش 2 برابری شدت نور می شود. افزون بر این، جهش یافته k77e/t69r نشر نور لوسیفراز را به میزان دو برابر ولی به صورت کوتاه مدت افزایش داد. برعکس، جهش یافته های g75e، k77e و g75e/t69r نتوانستند نشر نور لوسیفراز را در in vitro افزایش دهند و جهش یافته های k77e/g75e و k77e/g75e/t69r رفتار حد واسط داشتند. به علاوه، نتایج مطالعه مشخص نمود که در غیاب t-lre (t69r)، غلظت های 5 میلی مولار از d و l-cysteine سبب افزایش معنادار در نشر و زمان نشر نور لوسیفراز شده و decay rate نشر لوسیفراز را کاهش می دهند. بر مبنای مطالعات فعالیت، آنالیز far-uv cd، نتایج فلورسانس ans و dls آنزیم لوسیفراز در حضور و عدم حضور d-cysteine، آمینواسید d-cysteine مستقیما لوسیفراز را تحت تأثیر قرار می دهد زیرا پتانسیل redox ضعیف داشته، دارای خاصیت ضد تجمعی (anti-aggregatory) است و کنفورماسیون و ویژگی های سینتیکی لوسیفراز را تغییر می دهد. در یک جمع بندی کلی می توان گفت که احتمالاً آمینواسیدهای جهش یافته در جایگاه فعال آنزیم t-lre قرار دارند، به نظر می رسد که در جهش یافته t69r اسیدآمینه arg69 جایگزین شده که معادل arg218 لوسیفراز می باشد، اتصال به آکسی لوسیفرین را بهبود می بخشد و حضور آمینواسیدهای gly75 و نیزk77 جهت عملکرد مطلوب آنزیم چندکاره t-lre ضروری می باشد. به علاوه، بر مبنای این پژوهش می توان گفت که بخش اعظم افزایش در میزان و زمان نشر نور در واکنش های جفت شده lre و لوسیفراز در مطالعات قبلی از تأثیر مستقیم d-cysteine بر ساختار و فعالیت لوسیفراز حاصل شده است.

اورسولیک اسید یک ترکیب تری ترپن چربی دوست می باشد که روی عملکرد بافت ماهیچه اسکلتی اثر می گذارد. با این وجود هنوز مکانیسم عمل این ترکیب شناخته نشده است. در این مطالعه از سلول های ماهواره ای و ماهیچه اسکلتی موش بعنوان مدل آزمایشی استفاده شد. نتایج فاز in vitro نشان داد که اورسولیک اسید از طریق افزایش در بیان ژن های sirt1 (35 برابر) و pgc-1? (175 برابر) در سلول های ماهواره ای منجر به تکثیر این سلول ها می شود ( 4/3 برابر) که این آغاز ساز تولید ماهیچه های جدید در مدل حیوانی است. سپس، با توجه به نقش sirt1 در مصرف انرژی، این سوال به ذهن رسید که آیا اورسولیک سطح انرژی سلولی در ماهیچه های حیوانی را تغییر می دهد. یافته ها نشان داد که اورسولیک اسید حامل های انرژی از جمله atp (3 برابر) و adp (18 برابر) را کاهش می دهد، اما به منظور جبران این فرایند منجر به افزایش بیوژنز میتوکندری (12 برابر) و نسبت atp/adp (3 برابر) می شود. بعلاوه، اورسولیک اسید بیان میوگلوبین ( 2 برابر) را همگام با تغییر در بافت ماهیچه اسکلتی از نوع غیر هوازی تند انقباظ iib به هوازی اکسیداتیو تند انقباظ iia (30%) و کند انقباظ (4%) افزایش می دهد. سرانجام، این مطالعه نشان می دهد که اورسولیک اسید به طور غیر مستقیم اثرات مثبت ورزش و محدودیت کالری را با القاء در جوان سازی بافت ماهیچه ای و بهبود عملکرد تقلید می کند. همچنین نتایج این مطالعه اورسولیک اسید را بعنوان یک کاندیدای مناسب برای درمان شرایط آسیب شناسی مرتبط به تحلیل و اختلال عضلانی پیشنهاد می کند.

واکنش آنزیمی بیولومینسانس با دخالت آنزیم لوسیفراز توسط کاتالیز اکسیداسیون لوسیفرین (lh2) در حضور atp و mg2+ و مولکول اکسیژن رخ داده و منجر به نشر نور می شود. لوسیفراز به-طور گسترده ای به عنوان گزارشگر مورد استفاده قرار می گیرد زیرا دارای حساسیت بالا و گستره فعالیت خطی است. نیاز روزافزون به آنزیم های سازگار از نظر اقتصادی و صنعتی در زیست شناسی، بیوتکنولوژی و پزشکی توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده است. روش های متعددی برای افزایش پایداری حرارتی پروتئین به کار می رود. در این مطالعه، روش جهش زائی هدفمند به عنوان یک روش منطقی برای جایگزینی گلوتامیک اسید 428 به گلوتامین و لیزین انتخاب شده است. مطالعات دینامیک مولکولی انجام گرفته روی لوسیفراز گونه photinus pyralis نشان داده است که چگالی زیاد بار منفی در این موقعیت آن را انعطاف پذیر کرده است. بنابراین انعطاف پذیری آنزیم از طریق جایگزینی با اسید آمینه های هم اندازه اما با بار متفاوتی چون لیزین (بار مثبت) و گلوتامین (قطبی بدون بار) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که جایگزینی لیزین باعث کاهش فعالیت، فعالیت ویژه و پایداری حرارتی شده در حالی که جایگزینی گلوتامین رفتاری مشابه با پروتئین نوع وحشی دارد. مطالعات سینتیکی نشان داد که میزان km برای atp برای هر دو جهش یافته نسبت به نوع وحشی افزایش یافته، که نشان دهنده کاهش تمایل آنزیم به atp می-باشد، در حالی که میزان تمایل آنزیم به لوسیفرین در جهش یافته e428q افزایش یافته ولی در جهش یافته e428k تغییر محسوسی ندارد. بررسی های ساختاری، فشردگی ساختار آنزیم لوسیفراز در مورد جهش یافته e428k را تایید می کند که منجر به کاهش ساختار منظم در پروتئین می شود. در مورد جهش یافته e428q این تغییرات ساختاری موضعی بوده و منجر به باز شدن ساختار آنزیم شده است.

رگزایی فرآیند فیزیولوژیکی مهمی است که در مواردی مانند ترمیم زخم دخالت دارد. رگزایی نه تنها در شرایط فیزیولوژیکی بلکه در بیماری هایی مانند بیماری شبکه دیابتیک، ورم شریان شبه رماتیسمی و سرطان نیز دیده می شود. اندواستاتین یکی از پروتئین های ضدرگزایی می باشد که از طریق مهار فرایند رگزایی مانع رسیدن اکسیژن و موادغذایی به تومور می گردد. علاوه بر این ثابت شده که اندواستاتین منجر به القای آپوپتوز در سلول های سرطانی شده و نهایتا اندازه غده سرطانی را با مهار رگزایی و القای آپوپتوز کاهش می دهد.. 27 باقی مانده انتهای آمینوی این پروتئین مسئول بخش اعظمی از عملکرد ضدرگزایی این پروتئین می باشد، در این مطالعه تاثیر این قطعه بر القای مسیر داخلی آپوپتوز در سلول های اندوتلیال بند ناف جنین انسانی بررسی شد. نتایج نشان داد که عملکرد این قطعه وابستگی شدیدی به اتصال zn و تشکیل لوپ ابتدایی این پپتید دارد. مطالعات in vitro نشان داد که پس از اتصال zn به این قطعه کشندگی شدیدی در سلول های اندوتلیالی مشاهده می شود. مطالعات بیشتر نشان داد که این کشندگی با فعالسازی مسیر آپوپتوز همراه بوده و فعالیت شدیدی در کاسپازهای 3 و 7 مشاهده گردید. پس از بررسی فعالیت کاسپاز 9 مشخص شد که این قطعه 27 آمینواسیدی توانایی القای مسیر داخلی آپوپتوز، در سلولهای اندوتلیالی بند ناف جنین انسان را نیز دارا می باشد. مطالعات تکمیلی آشکار ساخت که غلظت atp داخل سلولی پس از تیمار با پپتید افزایش می یابد و در ادامه با آغاز مسیر آپوپتوز غلظت آن رو به کاهش می رود. همچنین فعالیت کمپلکس تنفسی به دنبال کاهش غلظت atp افزایش می یابد. مطالعات وسترن بلاتینگ نیز اثبات کرد که سیتوکروم c نیز در طی آپوپتوز از میتوکندری آزاد شده و وارد سیتوپلاسم می گردد که تائید محکمی بر آغاز آپوپتوز از مسیر داخلی می باشد.

پیشرفت های اخیر در زمینه مهندسی نانوساختارها و طراحی در سطوح مولکولی منجر به توسعه کاربرد نانوزیست مواد در ژن رسانی، دارورسانی، مهندسی بافت و تصویربرداری شده است. در این میان نانو زیست مواد مبتنی بر پپتیدها به دلیل تنوع ساختاری و انعطاف پذیری در طراحی، توجهات بسیاری را به خود جلب کرده اند. ژن درمانی انتقال ژن جدید به داخل سلول های یک فرد بیمار جهت درمان است. مانع اصلی انتقال موفقیت آمیز ژن به سلول های بدن بیماران، عدم وجود حامل مناسب انتقال ژن می باشد. ویژگی های اصلی یک حامل مناسب و کارا جهت کاربردهای بالینی عبارتند از عدم سمیت، عدم ایمنی زایی، کارایی انتقال ژن بالا، اختصاصیت برای سلول های هدف و باصرفه بودن از لحاظ اقتصادی است. مطالعات بسیاری در زمینه حامل های انتقال ژن در حال انجام است و پیشرفت های چشمگیری حاصل شده است. با وجودی که انتقال ژن با استفاده از ویروس ها با کارایی بالا انجام می شود اما این روش با محدودیت هایی بسیار از جمله احتمال برگشت ویروس به حالت بیماریزایی، ایمنی زائی و ظرفیت پایین برای ماده ی ژنتیکی، مواجه است. روش جایگزین برای انتقال ژن استفاده از سیستم های غیر ویروسی است. لیپیدهای کاتیونی یا لیپوزوم های کاتیونی، پلیمرهای کاتیونی، پروتئین و پپتیدهای کاتیونی از جمله شناخته شده ترین سیستم های غیرویروسی به شمار می روند. علی رغم کارایی پایین تر انتقال ژن در این سیستم ها نسبت به سیستم های ویروسی، به دلیل سمیت پائین تر بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. یکی از حامل های مهم انتقال ژن به سلول های یوکاریوتی پپتیدهای کایمریک سنتز شده با روش های مهندسی ژنتیک است. این پپتیدها متشکل از دمین های متعددی هستند که با الهام و تقلید از توالی های پپتیدی موجود در طبیعت به ویژه ویروس ها طراحی شده اند و تولید و سنتز آن ها با کمک سیستم های زیستی همچون باکتری e. coli انجام می شود. ویژگی اصلی این حامل ها در مقایسه با سایرین، موفقیت آن ها در غلبه بر سدهای سلولی همچون غشای سلولی، لیزوزوم و غشای هسته می باشد. در این پروژه ابتدا تمرکز بر روی طراحی، کلونینگ ژن، بیان و تخلیص سه نوع پپتید کایمریک قرار گرفت. این پپتیدها در ساختارشان دارای سه دمین اصلی به قرار زیر هستند: 1) دو تکرار از توالی 16مری پپتید کوتاه شده ی هیستون h1 جهت اتصال به dna پلاسمیدی، 2) فیوژن پپتید مشتق شده از گلیکوپروتئین 41 ویروسhiv جهت خروج از غشاء اندوزوم و 3) سیگنال قرارگیری در هسته یا nlsکه متعلق به آنتی ژن t بزرگ ویروسsv40 می باشد. در ادامه پروژه، توانایی تشکیل کمپلکس پایدار بین پپتیدهای مورد نظر و dna پلاسمیدی و در نهایت کارایی ترانسفکشن کمپلکس های حاصل به سلول های یوکاریوتی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که پپتیدهای مورد بررسی به طور موثری با dna پلاسمیدی اتصال برقرار کرده و نانوذراتی با میانگین اندازه ی ذره ای حدود 100 نانومتر ایجاد می کنند. همچنین مشخص شد که دمین فیوژن پپتید مورد استفاده در ساختار این پپتیدها، قادر به نفوذ به غشاء اندوزوم می باشد. بازده بالای ترانسفکشن نانوذرات حاصل، حاکی از موفقیت آن ها در انتقال ژن به سلول ها می باشد و نویدی برای تشکیل حامل های ژن غیرویروسی موثر و غیر سمی به شمار می روند.

همان گونه که اشاره شد نانوکلاستر های فلورسنت بر اساس نوع خصوصیات آنها، کاربردهای بسیاری در علوم مختلف دارند. بنابراین در این رساله حسگری برای آنالیز یون مس (ii) بر اساس تجمع یافتن نانوکلاستر های طلا که منجر به خاموشی شدت نشر می شود و آنالیز هیستیدین براساس واکنش هیستیدین با یون مس که منجر به روشن شدن نشر می شود، طراحی شد. همچنین آنالیز پراکسید هیدروژن و گلوکز بر اساس پدیده انتقال الکترون درون مولکولی که شدت نشر را تقویت می کند، امکان پذیر شد. بعلاوه براساس پدیده pet و با بکارگیری آپتامر برای سنتز نانوکلاستر های نقره، سیتوکروم c در محیط کشت سلولی اندازه گیری گردید. در نهایت خاصیت الکتروکاتالیستی نانوکلاستر های پلاتین در فرایند احیای اکسیژن (orr) و تصویربرداری سلولی مورد بررسی قرار گرفت.

کلسترول اکسیداز ( cho, ec 1.1.3.6) یک الکل دهیدروژناز/ اکسیداز متعلق به خانواده ی گلوکز -متانول-کولین (gmc) اکسیدوردوکتاز و وابسته به فلاوین آدنین دی نوکلئوتید (fad) است که اکسیداسیون کلسترول (cholest-5-en-3?-ol) را با مصرف اکسیژن مولکولی برای ایجاد cholest-4-en-3-one و پراکسید هیدروژن (h2o2) کاتالیز می کند. با توجه به ویژگی سوبسترایی و فعالیت، کلسترول اکسیداز مشتق شده از سویه های استرپتومایسس در کیت های سنجش کلسترول مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق نیز از یک سویه ی بومی استرپتومایسس استفاده شد. ژن مورد نظر پس از تکثیر، در وکتور بیانی pet28a کلون و در باکتریdh5? e.coli انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت.بیان پروتئین در سویه bl21 e.coli مورد بررسی قرار گرفت، از آنجایی که درصد بالایی از پروتئین به شکل اجسام توده ای بیان می شدند، به منظور افزایش بیان پروتئین به فرم محلول شرایط مختلف دمایی، زمانی و میزان القاکننده iptg در سویه های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان، تخلیص آنزیم، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز انجام و فعالیت آنزیم سنجیده شد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

امروزه کشاورزی مولکولی و تولید گیاهان تراریخته، باعث شده است که از گیاهان برای درمان بیماری هایی استفاده شود که تا پیش از این به وسیله داروهای شیمیایی یا مواد زیستی بدست آمده از حیوانات یا میکروارگانیسم ها درمان می شدند. از این رو گیاهان تراریخته می توانند به عنوان بیوراکتور جایگزین مناسبی برای سیستم های رایج بیان کننده پروتئین های نوترکیب باشند. یکی از داروهای مهم برای سکته های قلبی و مغزی، پروتئین نوترکیب t-pa (اسم تجاری اکتیواز یا آلتپلاز ) است که به دلیل کمیاب بودن و قیمت بالا در دسترس عموم بیماران نیست. به همین علت اهمیت تولید آن در کشور فوق العاده زیاد احساس می شود. در این تحقیق گیاهان توتون تراریخت تولید شده توسط گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، به منظور استخراج و تخلیص پروتئین t-pa کشت داده شد. جهت بررسی بیان ژن در گیاهان تراریخت و اطمینان از تراریخت بودن آنها، از روش های مقاومت به آنتی بیوتیک، pcr و rt-pcr استفاده شد. با کشت بذر روی محیط کشت ms حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین فقط گیاهان تراریخت قادر به جوانه زنی شدند. همچنین در روش های pcr و rt-pcr تکثیر ژن t-pa با آغازگر اختصاصی نشان داد که فقط گیاهان تراریخت در مقایسه با شاهد، باند تکثیر شده مربوطه(1.7kb) را نشان دادند. همچنین در مرحله رونویسی مشخص شد که یک باند اضافی (650bp) تکثیر می شود که بعد از توالی یابی و جستجوی توالی های همپوشان مشخص شد که همان cdna ژن t-pa می باشد فقط توالی دامنه های کرینگلی t-pa از آن حذف شده است. بعد از تایید تراریخت بودن و بیان ژن در گیاهان، به کمک روشهای کروماتوگرافی تمایلی لیزین سفارز و فیلتراسیون ژلی اقدام به تخلیص t-pa نوترکیب انسانی گردید و با الکتروفورز ژل sds خالص بودن t-pa و به کمک آزمون زیموگرافی فعال بودن این پروتئین نشان داده شد.

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب (ec; 1.13.12.7 ) اکسیداسیون لوسیفرین را در حضور یون های منیزیم، atp و اکسیژن مولکولی کاتالیز می کند. لوسیفراز آنزیمی تک زیر واحدی (62 kda) و دارای دو دمین n- ترمینال و c- ترمینال می باشد. این آنزیم، به عنوان ژن گزارشگر در in vivo imaging کاربردهای بسیار زیادی دارد. لوسیفراز در مقابل پروتئازها حساس و به سرعت غیر فعال می شود. تیمار این آنزیم با تریپسین نشان داده است که در شش جایگاه k206) ، r213، r218 ،k329، r330 و r337) واقع در دومین n- ترمینال برش داده می شود. چهار جایگاه برش k206) ، r218 ،k329، r330) در بین تمامی لوسیفرازها حفاظت شده می باشند. در این تحقیق اسید آمینه آرژینین213 (حفاظت شده نمی باشد)، به عنوان یک جایگاه جهش مورد توجه قرار گرفت و با متیونین و گلوتامات جایگزین شد. آرژینین 337 به عنوان جایگاه دیگری برای ایجاد جهش انتخاب و جهش یافتهr337q در این ناحیه طراحی گردید. جهش یافته دیگر براساس تاثیر پرولین بر کاهش احتمال برش طراحی گردید، در این حالت گلوتامین 338 (بعد از آرژینین 337) با پرولین جایگزین شد. برای ایجاد جهش از روش جهش زایی هدفدار به روش soe-pcr استفاده گردید. بعد از تخلیص پروتئین های جهش یافته و طبیعی، مطالعات پروتئولیز محدود در حضور تریپسین و کیموتریپسین برای بررسی پایداری جهش-یافته ها در حضور پروتئازها انجام شد. همچنین جهت بررسی تغییرات ساختاری از مطالعات فلورسانس استفاده شد. مطالعات فلورسانس نشان دهنده فشرده تر شدن ساختار پروتئین در اثر جهش های حاصله است که این تغییرات ساختار همراه با افزایش پایداری حرارتی و پایداری پروتئولیتیکی جهش یافته ها می باشد. این افزایش پایداری برای جهش یافته r337q قابل توجه بوده به طوریکه در سلول های یوکاریوتی نیز نسبت به لوسیفراز طبیعی پایدارتر می باشد.