بهینه سازی ژن لوسیفراز به عنوان گزارشگر مناسب جهت بیان در گیاه

چکیده: آنزیم لوسیفراز عامل اصلی پدیده بیولومینسانس یا نشر نور توسط موجودات زنده است. بیولومینسانس به فرآیند تبدیل انرژی شیمیایی به نور در سیستمهای زیستی گفته میشود و به دو جزء اصلی یعنی آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین بستگی دارد. این فرایند در دسته وسیعی از جانداران آبزی و خشکیزی مشاهده و گزارش شده است. آنزیمهای درگیر در این فرایند با نام کلی لوسیفراز نامگذاری شده اند. واکنش آنزیمها عموماً منجر به تولید نور سبز- زرد می شود . به دلیل کاربرد فراوان لوسیفراز حشره شبتاب، بیشتر مطالعات بر روی این آنزیم صورت گرفته است. این آنزیم با استفاده از atp و mg2+ ،o با انجام عمل اکسیداتیو، دکربوکسیلاسیون بر روی سوبسترای –d لوسیفرین، نور سبز- زرد و نیز آدنوزین مونوفسفات co2 (amp) اکسی لوسیفرین و پیروفسفات (ppi) تولید می کند . ژن لوسیفراز به عنوان ژن گزارشگر بسیار حساس، کاربرد فراوان دارد. به طور معمول، تولید لوسیفراز نوترکیب عمدتاً به سیستمهای میکروبی وابسته است. لوسیفراز نوترکیبی که در این سیستم ها بیان میشود، به دلیل ماهیت پروکاریوتی سیستم بیانی باکتریها، فاقد خصوصیات مطلوب آنزیمی و پایداری مناسب می باشد، اما فرآیندهایی نظیر تشکیل باندهای دی سولفیدی ، تاخوردگی و گلیکوزیلاسیون در سیستمهای بیان گیاهی به طرز صحیح صورت می گیرد. همچنین فرمهای تجاری موجود این آنزیم، بسیار گرانقیمت بوده و استفاده از آنها مقرون به صرفه نیست. امروزه ژنهای گزارشگر نقش بسیار مهمی در مهندسی ژنتیک دارد. برای بهینه سازی ژن لوسیفراز جهت بیان مناسب در گیاه سعی در حذف و تغییر چندین نوکلئوتید در ژن خواهد شد. بدین منظور پرایمرهای تخصصی با استفاده از نرم افزارهایgene runner , oligo analyzer و genious طراحی شده و برای افزایش بیان ژن در گیاه تمهیداتی نظیر اضافه کردن توالی کزاک همچنین حذف توالی پراکسی زومی از انتهای ژن و ... در نظر گرفته شد . در این پژوهش ژن لوسیفراز که بر اساس ترجیح کدونی برای سلولهای گیاهی به صورت codon optimize شده توسط شرکت promega سنتز شده بود بعد از اعمال تغییرات به وسیله پرایمرها با تکثیر از طریق pcr با آغازگرهای اختصاصی در ناقل ویروس کلون شد. و سپس با روش saat به سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 منتقل شدند. برای تهیه سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 ابتدا بذرها شستشو داده شد و سپس در محیط ms بدون هورمون کاشته شد بعد از گرفتن گیاه کامل برگها به محیط القا کالوس منتقل شدند سپس کالوسها را به محیط مایع ls جهت جدا شدن سلولهای کالوس از یکدیگر منتقل شد. ناقل کلون شده را با استفاده از روشهای ذکر شده به این سلولها منتقل نموده و سپس با استفاده از دستگاه لومینومتر مقدار فعالیت این آنزیم در گیاه به صورت in vivo اندازه گیری شد.