هزاران سال است که از گیاهان به عنوان منشأ دارو استفاده می شود. سازمان بهداشت جهانی تخمین زده است که امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان هنوز از داروهای گیاهی برای درمان بیماری-ها استفاده می کنند. متابولیت های ثانویه از جمله اقتصادی ترین مواد در فرآیند تولید دارو، مواد معطر، رنگدانه ها، افزودنی های غذایی و آفت کش ها هستند. هر ساله تکنیک های متفاوتی برای افزایش بیومولکول ها در گیاهان دارویی به وجود می آید. زیست فن آوری ابزاری مهم برای افزایش بهره وری از گیاهان دارویی با روش هایی مثل باززایی در شرایط درون شیشه ای و انتقال ژنتیکی است. امروزه با بکارگیری انتقال ژن و روش های مهندسی ژنتیک، تولید گیاهان تراریخت با برتری های متعدد از جمله در خصوصیات مربوط به رشد، عملکرد، کیفیت غذایی بالاتر و مقاومت به آفات و بیماری ها و علف کش ها امکان پذیر شده است. از طرفی پیشرفت در کشت بافت همراه با فن های مهندسی ژنتیک و به ویژه فن تراریخت کردن گیاهان راه جدیدی برای تولید مقدار بالای ترکیبات دارویی و سایر ترکیبات مفید فراهم کرده است. یکی از مهمترین گیاهان دارویی دنیا خانواده papaverace می باشد که قابلیت تولید آلکالوئیدهای دارویی مهمی را دارند. تیره خشخاش دارای 23 جنس و 200 گونه است که از این میان جنس papaverو گونه papaver somniferum دارای اهمیت زیادی می باشد. خصوصیات دارویی این گونه مربوط به قابلیت تولید و بیوسنتز گروهی از آلکالوئیدهای بنزوفنانتریدین از زیر گروه آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینی می باشد. آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینی گروه متنوعی از ترکیبات ازت دار هستند که پراکنش تاکسونومی محدودی در بین گیاهان دارند. بیش از 100 آلکالوئید مختلف از پیش ماده اولیه ال- تیروزین و ماده حدواسط مرکزی اس رتیکولین ساخته می شوند که مهمترین این مواد تبائین، سانگوئینارین، کدئین و مرفین هستند. مرفین به همراه مواد شیمی درمانی دیگر نظیر وین کریستین، وین بلاستین و کامپتوتسین از آلکالوئیدهای مهم تجاری شده هستند که از این گیاه استخراج می شوند. بسیاری از این آلکالوئیدها دارای خصوصیات و فعالیت مهم دارویی می باشند و برخی نیز به عنوان دارو مورد استفاده قرار می-گیرند، به عنوان مثال می توان به مسکن هایی نظیر مرفین و کدئین، آنتی بیوتیک هایی مانند سانگواینارین با خاصیت ضدمیکروبی و ضدالتهابی، نوسکاپین ها با خاصیت ضدسرفه و ضدتوموری، پاپاورین به عنوان گشادکننده رگ ها و توبوکورارین شل کننده عضلات اشاره نمود. سنتز شیمیایی این ترکیبات ارزشمند به دلیل ساختار پیچیده شان بسیار سخت است. بنابراین گیاهان وحشی یا اهلی به عنوان تنها منبع تجاری تامین کننده این ترکیبات مورد توجه می باشند (حسینی و همکاران، 1387). جداسازی ژن های موثر در بیوسنتز مرفین جهت بهبود مهندسی متابولیک گیاه خشخاش و تولید آلکالوئیدهای ویژه اهمیت زیادی دارد. یکی از توانایی های ارزشمند استفاده از مهندسی ژنتیک، دستورزی مسیرهای بیوسنتتیک سلول گیاه و هر یک از متابولیت ها می باشد. میزان تولید مواد آلکالوئیدی مختلف را می توان با استفاده از دستورزی ژنتیکی آنزیم های کلیدی شرکت کننده در مسیر متابولیکی تولید مرفین و کدئین تغییر داد. کدئین آلکالوئیدی است که به طور طبیعی از خشخاش برداشت می شود، اما90 تا 95 درصد از کدئین سنتزی از مرفین با فرایندهای نیمه سنتزی به دست می آید. از کدئین برای داروهای نارکوتیک از قبیل دی هیدروکدئین (dihydrocodeine) و هیدروکدن (hydrocodone) نیز استفاده می شود. میزان مصرف کدئین در دنیا در سال 2009 در حدود 254 تن، اکسی کدن (oxycodone) و هیدرومرفین (hydromorphone) به ترتیب 77 تن و 7/3 تن گزارش شد، که از این میزان مصرف مقدار7/30 تن دی هیدروکدئین و 9 تن فول کدن (pholcodine) و حدود 6/1 تن اتیل مرفین (ethylmorphine) تنها مربوط به کشور امریکا بوده است. کشور ایران نیز با مصرف 5/14 تن در سال 2009 جزو عمده ترین کشورهای گزارش شده در مصرف کدئین است. از طرفی فرانسه در همین سال 5/32 تن یعنی 25 درصد از تجارت دنیا را در صادرات کدئین داشته است. استرالیا نیز 6/24 تن یعنی 19 درصد صادرات دنیا را از آن خود کرده است. طبق آمارهای سال 2009 تقریبا 84 درصد از مرفین و 95 درصد از تبائین سنتزی کل دنیا از خشخاش به دست می آید. عصاره آلکالوئیدهای ایرانی از لحاظ عصاره آلکالوئیدی و کیفیت آن بالاترین کیفیت را در دنیا دارا است ((unodc, 2010. با توجه به مصرف و نیاز روبه رشد جامعه به این داروها باید تدابیری اتخاذ شود تا هر چه بیشتر در جهت رفع این نیاز برای جامعه بشری اقدام گردد، از طرفی چون کشت این گیاه به دلیل تولید مواد مخدری مرفین و سوء استفاده از این ماده، محدود شده است خلاء بزرگی در صنعت داروسازی دنیا برای تولید متابولیت های مفید این گیاه به وجود آمده است و چون سنتز این مواد در آزمایشگاه پیچیده و گران است و گاهاً مواد اضافه شده با آن، ماده موثره آن را تحت تاثیر قرار می دهد دانشمندان زیست فن آوری گیاهی بر آن هستند تا با دستکاری ژنتیکی، سنتز متابولیت های مفید در این چرخه را افزایش دهند. یکی از کارهایی که می تواند صورت گیرد، خاموشی از طریق قطع یا مهار یک ژن بیان شده در سطح نسخه برداری یا خاموشی ژن با استفاده از تداخل rna (rnai ) است. در این راستا تلاش شده است که سازه خاموشی یکی از کلیدی ترین آنزیم های این مسیر یعنی آنزیم کدئینون ردوکتاز جداسازی و همسانه سازی شود و به منظور کاربردهای مهندسی متابولیک ساخته شود و به گیاه منتقل گردد. همچنین جهت بهینه سازی انتقال ژن به این گیاه تیمارهای مختلفی مورد بررسی قرار گرفته اند تا خاموشی این ژن بررسی گردد چرا که یکی اهداف عمده این تحقیق افزایش متابولیت های باارزش بالادست این ژن است. لازم به ذکر است که این تحقیق اولین گزارش در مورد خاموشی این ژن بر روی ارقام بومی ایران و دومین گزارش خاموشی این خانواده ژنی در دنیا است.

استفاده از گیاهان به عنوان منبع تولید دارو از قدیم مورد توجه بشر بوده است. بیوتکنولوژی مدرن این امکان را فراهم نموده است که پروتئین های با ارزش دارویی در گیاهان تولید گردد. بیان ژن در بافت های مختلف گیاهی امکان پذیر است، اما بیان پروتئین در بذر موجب تجمع پایدار آن در غلظت نسبتاً بالا و حجم کم و فشرده می شود که برای ذخیره سازی و استخراج مناسب است. استفاده از بذور روغنی و بیان پروتئین نوترکیب در ترکیب با اولئوسین تمام مزایای بیان در بذر از جمله ظرفیت بالای تولید، افزایش پایداری و از همه مهم تر سهولت در تخلیص را دارد. اولئوسین سبب هدف گیری صحیح پروتئین به اندام های روغنی بذر شده و سبب استخراج راحت تر و ارزان تر از آن می گردد. گلرنگ (carthamus tinctorius l.) یک گیاه دارای بذر روغنی است که امروزه با هدف استخراج روغن از آن کشت می شود. خودگشنی، خوراکی نبودن بخش های رویشی گیاه، پایداری در آب و هوای گرم و خشک و سطح زیر کشت پایین گلرنگ سبب شد تا به عنوان گیاه میزبان جهت انتقال ژن اینترفرون گامای انسانی در ترکیب با اولئوسین انتخاب شود. تولید اینترفرون گاما در بدن در واکنش به فعالیت میکروب ها و محصولات آنها رخ می دهد و به عنوان عامل مختل کننده همانندسازی و رشد ویروس ها شناخته می شود. در این تحقیق ژن های اینترفرون گامای انسانی-اولئوسین که تحت پیشبرنده بذری napin در پلاسمید pbi121 کلون شده و به اگروباکتریوم سویه lba4404 انتقال یافته بود، با استفاده از تکنیک colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد. تیمارهای هورمونی متفاوتی به منظور باززایی گلرنگ طراحی شده و محیط حاوی نمک های ms و ویتامین b5 و بدون هورمون به عنوان تنها محیط القای ریشه به همراه نوساقه شناخته شد. در این راستا ریزنمونه های برگ لپه ای رقم پدیده گلرنگ برای تلقیح توسط اگروباکتریوم مورد استفاده قرار گرفت. پلاسمید نوترکیب pbi121 حاوی ژن اینترفرون گامای انسانی به کمک اگروباکتریوم به گیاه گلرنگ منتقل گردید و تعدادی گیاه تراریخت به دست آمد. گیاهان تراریخت بر روی محیط ms (ویتامین b5) حاوی mg l-1 40 آنتی بیوتیک کانامایسین انتخاب شدند. آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت وجود ژن اینترفرون گامای انسانی را در ترکیب با اولئوسین تأیید نمود.

امروزه کشاورزی مولکولی پتانسیل بالایی در تولید نامحدود واکسنها، آنتیبادیها، پروتئینهای دارویی، عامل های رشد و آنزیمها دارد. فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tpa)، سرین پروتئازی است که نقش مهمی در سیستم فیبرینولیتیک و انحلال لخته های فیبرین در انسان دارد و به طور عمده در کبد و جداره رگ های خونی سنتز می شود. در بین سیستمهای موجود انتقال ژن، انتقال توسط اگروباکتریوم به عنوان یک روش مناسب برای الحاق پایدار ژنها به ژنوم گیاه به شمار میرود. این در حالی است که انتقال ژن توسط اگروباکتریوم هنوز در برخی گونه های گیاهی سرسخت از جمله خیار (cucumis sativus l.) با مشکل مواجه است. خیار یکی از مهمترین محصولات صیفی جهان می باشد که در بین سبزی های مهم، مقام چهارم را دارا است. در این مطالعه، ابتدا به منظور بررسی باززایی مناسب گیاه خیار واریته اصفهان، از شش تیمار هورمونی استفاده شد. سپس، ژن tpa انسانی که تحت پیشبرنده camv 35s توسط گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس در پلاسمید pbi121 کلون شده بود به اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل گردید و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید گشت. به منظور انتقال ژن tpa، ریزنمونه های خیار، توسط اگروباکتریوم lba4404 حاوی سازه pbi121-tpa تلقیح شده و پس از هم کشتی، به محیط گزینشگر شامل آنتی بیوتیک های کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهان باززا شده بر روی محیط گزینشگر، پس از تولید نوساقه به ترتیب به محیط ریشه زایی و کوکوپیت منتقل شدند. بررسی این گیاهان در سه سطح dna، rna و پروتئین انجام پذیرفت. تراریخته بودن گیاهان حاصل، توسط آغازگرهای اختصاصی و با کمک واکنش pcr مورد تأیید قرار گرفت. به منظور بررسی بیان ژن tpa در گیاهان تراریخته، rna استخراج و آزمون rt-pcr رونویسی ژن tpa را در آن ها تأیید کرد. به منظور بررسی تولید پروتئین tpa نوترکیب، پس از استخراج پروتئین از برگ، از آزمون های dot-blot و sds-page استفاده و حضور پروتئین tpa در گیاهان تأیید گشت. برای سنجش میزان پروتئین tpa نوترکیب در گیاهان خیار تراریخته، از آزمون elisa استفاده شد.

تولید زیست داروها و پروتئین های نوترکیب با استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتور در حجم انبوه و ارزان تحت عنوان زراعت ملکولی (molecular farming) معرفی می شود. دیابت به عنوان نارسایی سوخت و سازی گروه بندی شده است که در آن بدن از فقدان و یا عدم امکان استفاده از هورمون انسولین رنج می برد. با وجود تولید انسولین در سیستم های باکتریایی و مخمری تحقیقات بیشتر برای سایر روش های تولید پروتئین انسولین شامل بیان در گیاهان متمرکز شده است. گیاه توتون با نام علمی nicotiana متعلق به خانواده solanaceae و گونه tabacumمی باشد که تاکنون بیشترین استفاده را جهت تولید پروتئین های نوترکیب در بین گونه های گیاهی به خود اختصاص داده است. پروتئین های نوترکیب تولیدی در گیاهان می توانند به واحدهای زیرسلولی متفاوت در سلول های گیاهی نظیر سیتوزول، آپوپلاست، شبکه آندوپلاسمی، کلروپلاست و یا واکوئل هدف گیری شوند. انتخاب صحیح واحد زیر سلولی جهت بیان پروتئین نوترکیب، نقش مهمی در سطوح تولید پروتئین های هترولوگ دارد. بیان پروتئین های نوترکیب در کلروپلاست مزایای متعددی نظیر افزایش بیان ژن هدف و محدود نگه داشتن ژن انتقال یافته را به همراه دارد. ژن پروانسولین انسانی به همراه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین- استرپتومایسین توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی با استفاده از وکتور pkcz و به روش تفنگ ژنی به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافته است. در قالب این پروژه، مراحل انجام باززایی و انتخاب گیاهان تراریخته بر روی محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین به منظور افزایش هموپلاسمی طی حداقل سه نسل انجام شد. بررسی گیاهان ترانسپلاستومیک در سطوح مختلف dna، rna و پروتئین به منظور تایید درج و بیان ژن در کلروپلاست گیاه توتون انجام شد. بررسی این گیاهان در سطح dna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پروانسولین، درج این ژن را در ژنوم کلروپلاستی گیاهان تایید کرد، به علاوه با آزمون rt-pcr رونویسی ژن هدف تایید شد. همچنین آزمون های بلات نقطه ای، الیزا و وسترن بلات به منظور اثبات بیان ژن هدف در سطح پروتئین و تعیین میزان پروتئین تولید شده انجام شد. در ادامه این پروژه جوانه زنی بذور نسل t1 روی محیط ms حاوی غلظت های مختلف آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین نیز مورد بررسی قرار گرفت.

گوجه فرنگی یکی از مهمترین سبزیجات و گیاهان مدل جهت اصلاح سایر گیاهان دولپه ای است. با این حال روش تراریختی گوجه فرنگی هنوز یک روش روتین و قابل تکرار برای همه ارقام آن نیست .بنابراین توسعه روش تراریختی مستقل از ژنوتیپ و رقم ضروری است. نزدیک به 7/0 درصد جمعیت جهان به نوعی از دیابت مرتبط با انسولین رنج می برند و این آمار روز به روز در حال افزایش است. با توجه به اینکه تاکنون تنها درمان موثر دیابت، مصرف روزانه انسولین بوده است، تولید گیاهان نوترکیب با توان تولید چنین پروتئینهای مهمی،ضروری به نظر می رسد. هدف از انجام این تحقیق، بهینه سازی کشت بافت گوجه فرنگی در 3 رقم اوربانا ، ریو گرند و کلجی به منظور انتقال ژن پروانسولین انسانی می باشد. ژن موردنظر در ناقل pcambia1304 کلون گردیده است و ناقل حاوی ژن پرو انسولین به باکتری agrobacterium tumefaciens سویه lba4404 منتقل شده است تا انتقال ژن به روش اگروباکتریوم صورت گیرد. بذرهای گوجه فرنگی در شرایط درون شیشه ای کشت گردیده و کوتیلدونهای 9 تا 12 روزه آن به عنوان ریزنمونه جهت تراریختی مورد استفاده قرار گرفتند.به منظور تراریختی از دو روش استفاده شد تا درصد تراریختی به حد مطلوبی برسد. در روش اول از هورمون های bap و naa و در روش دوم از هورمون های زآتین ریبوزاید و iaa جهت باززایی استفاده شد. پس از تلقیح ریز نمونه ها با باکتری agrobacterium tumefaciens سویه lba4404 حاوی ناقل pcambia1304 ، ریز نمونه ها به محیط کشت انتخابی ms حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفاتوکسیم منتقل شدند. پس از باززایی ریزنمونه ها در این محیط های انتخابی، گیاهچه ها را به محیط ریشه زایی منتقل کردیم. درنهایت گیاهچه های ریشه دار شده به پرلیت استریل منتقل شده و پس از سازگار شدن به گلدان هایی با خاک مناسب منتقل شدند. بررسی مولکولی pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پروانسولین انسانی، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده صورت پذیرفت و تراریخت بودن آنها تائید شد.

تولید پروتئین‎های نوترکیب انسانی در سیستم‎های زیستی تحولی بزرگ در استفاده‎های دارویی بالینی از این مواد ایجاد کرده است. در این میان مزایای بی‎نظیر سیستم‎های گیاهی برای تولید پروتئین‎های نوترکیب بر کسی پوشیده نیست. یونجه با داشتن ویژگی‎های مطلوبی مثل چندساله بودن، تولید بالای پروتئین در برگ و تکثیر غیرجنسی آسان، پتانسیل تبدیل شدن به یک بیوراکتور قوی برای تولید پروتئین نوترکیب را دارد. باززایی در محیط این‎ویترو یکی از پیش‎نیازهای ضروری در پروژه‎های دستورزی ژنتیکی است. در بین روش های انتقال ژن به گیاهان، کارایی بالای انتقال به واسطه اگروباکتریوم، به خصوص برای گیاهان دولپه، به اثبات رسیده است. پروتئین نوترکیب t-pa انسانی، یکی از اساسی‎ترین آنزیم‎ها در مسیر تجزیه لخته‎های خونی می‎باشد. این پروتئین فوق‎العاده با ارزش، یکی از مهم ترین داروهای مورد استفاده در درمان سکته‎های مغزی و قلبی است. با توجه به کمیاب بودن و گران قیمت بودن این دارو، نیاز به تولید این پروتئین در یک سیستم، که هزینه‎های تولید را کاهش داده و آن را با قیمت پایین در اختیار بیماران قرار دهد، به شدت احساس می‎شود. در این تحقیق سازه‎ی حاوی ژن t-pa، ساخته شده در دانشگاه تربیت مدرس به وسیله اگروباکتریوم تومفاشینس به گیاه یونجه منتقل شد. باتوجه به وابستگی شدید باززایی این‎ویترو گیاه یونجه به ژنوتیپ، لازم بود ابتدا باززایی یک ژنوتیپ مطلوب از ارقام ایرانی یونجه بهینه‎سازی شود. برای افزایش کارایی انتقال ژن به این گیاه تغییراتی در محیط تلقیح و همکشتی ایجاد شد و همچنین دمای دوره همکشتی سه درجه پایین تر از حد معمول در نظر گرفته شد. حضور ژن در گیاهان ترانس‎ژن با استفاده از آزمون pcr تایید گردید.

امروزه اهمیت و ارزش بالای منابع ژنتیکی بیش از پیش درک شده است. تاحدی که بسیاری از دانشمندان و صاحب نظران ثروت یک کشور در آینده را با تعداد ژن های موجود در خزانه ژنی آن کشور ارزیابی می کنند. بدلیل فرسایش شدید ژنتیکی این ثروت ملی، ضرورت حفظ و حراست از این ودیعه های الهی و منابع گرانبها وظیفه هر ایرانی و بخصوص متخصصان و مسئولان این بخش می باشد. از بین منابع ژنتیکی موجود در کشور بیشترین میزان فرسایش در سبزیجات و صیفی جات رخ داده و همچنان در حال رخ دادن است. خربزه، طالبی و دستنبو گروه های مختلف از یک گونه هستند که با هم به راحتی تلاقی یافته و انواع حد واسط آنها بوجود آمده است و به همه آنها ملون گفته میشود. ایران یکی از مهمترین مراکز تنوع ژنتیکی ملون ها و همچنین سومین کشور تولید کننده آن ها در جهان محسوب می شود. در این مطالعه سعی گردید که به طور اختصاصی به ارزیابی صفات مختلف در تعدادی از طالبی های بومی ایران پرداخته شود. تعداد 15 صفت در 15 توده بومی طالبی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج مقایسات میانگین برای صفت وزن میوه نشان داد که توده چروک طالبی و حبیب آباد اصفهان به ترتیب دارای بیشترین میزان وزن میوه بود و خربزه طالبی سرخس با میانگین وزن یک و نیم کیلوگرم دارای کمترین خطای معیار برای این صفت بود که یک مزیت به حساب میآید. از نظر صفت محتوای مواد جامد محلول که میانگین کل تودهها نهونیم بریکس بود و تودههای خربزه طالبی سرخس، مگسی نیشابور، فیروزان و حبیب آباد اصفهان به ترتیب بیشترین مقدار را داشتند. نتایج حاصل از بررسی میزان همبستگی بین صفات نشان داد که صفات مرتبط با اندازه میوه با هم و با وزن میوه دارای همبستگی بالایی بودند و همچنین صفات مرتبط با مورفولوژی بوته با هم همبستگی بالایی داشتند. محتوای مواد جامد محلول نیز با مزه میوه و مورفولوژی بوته همبستگی بالایی داشت. تجزیه به عامل ها پنج عامل مستقل را که مجموعا 89/75 درصد از تغییرات کل داده ها را توجیه می کردند، محاسبه کرد. سه عامل اول با توجه به مهم ترین صفاتی که در بر گرفتند نام گذاری شدند. بایپلات صفات در دو مولفه اول با استفاده از نرم افزارgge biplot نتایج حاصل از تجزیه همبستگی و تجزیه به عامل ها را تایید کرد ولی ژنوتییپ ها کمتر با هم همبستگی نشان دادند و این نشان دهند? تنوع بالای آن ها می باشد. درتجزیه رگرسیون گام به گام صفت عرض میوه اولین صفتی بود که وارد مدل شد و به تنهایی حدود 8/77% از تغییرات صفت وابسته وزن میوه و صفت بعدی یعنی قطر حفره میوه به همراه عرض میوه 3/87% از تغییرات صفت وابسته وزن میوه را توجیه کردند. در تجزیه علیت همبستگی های بین وزن میوه و دو صفت مستقل، به اثرات مستقیم و غیر مستقیم تجزیه شد. مقدار اثر باقیمانده، برابر با 337/0 بود. بنابراین متغیر ها (عرض میوه و قطر حفره میوه) 66% از تغییرات وزن میوه را توجیه می کرد. نتایج حاصل از تجزیه خوشه ای به روش حداقل واریانس وارد توده ها مورد مطالعه را در سه گروه مجزا قرار داد.

در سه دهه گذشته فناوریهای نوین بخصوص زیست فناوری تحولات عظیمی ایجاد نموده اند و زراعت مولکولی در زمینه تولید داروهای نوترکیب مانند:( واکسنها،داروها،هورمونها و مواد صنعتی ) باعث انقلابی شگرف خواهد شد.امروزه زراعت مولکولی و تولید گیاهان تراریخته، باعث شده است که از گیاهان به عنوان بیورکتور های تولید مواد موءثر دارویی برای درمان بیماری هایی استفاده شود که تا پیش از این با استفاده از داروهای شیمیایی یا مواد زیستی بدست آمده از حیوانات یا میکروارگانیسم ها درمان می شدند. از این جهت گیاهان تراریخته می توانند به عنوان بیوراکتور جایگزین مناسبی برای سیستم های رایج تولید پروتئین های نوترکیب باشند.سکته های مغزی و قلبی اولین عامل مرگ ومیر در جوامع بشری هستندو یکی از داروهای مهم برای سکته های قلبی و مغزی، پروتئین نوترکیب t-pa (اکتیواز یا آلتپلاز ) است که به دلیل کمیاب بودن و قیمت بالا در دسترس عموم بیماران نیست. به همین علت اهمیت تولید آن در کشور فوق العاده زیاد احساس می شود.هدف اصلی از انجام این پروژه تحقیقاتی امکان سنجی تولید پروتئین نو ترکیب t-pa انسانی در گیاه گوجه فرنگی بود و بدین منظور در این تحقیق باکتری حامل ژن t-pa اهدائی از دانشگاه تربیت مدرس گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی تحویل گرفته شد و به گیاه گوجه فرنگی ارقام (فرعون و چری زیتونی و کال جی ) انتقال داده شد. ژن هدف t-pa انسانی با استفاده از روش اگروباکتریوم به سلولهای گیاه گوجه فرنگی منتقل گردید و به دلیل حضور ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین سلولهای تراریخته زنده مانده وباززایی شدند. جهت بررسی بیان ژن در گیاهان تراریخته و اطمینان از تراریخته بودن آنها، از روش های مقاومت به آنتی بیوتیک، pcr و rt-pcr استفاده شد. با کشت گیاهان تراریخت روی محیط کشت ms حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین فقط گیاهان تراریخت قادر به جوانه زنی وادامه رشد بودند. همچنین در روش های pcr و rt-pcr تکثیر ژن t-pa با آغازگر اختصاصی نشان داد که فقط گیاهان تراریخته در مقایسه با شاهد، باند تکثیر شده مربوطه (1.7kb) را نشان دادند.

امروزه مردم زیادی در جهان، به نوعی از دیابت مرتبط با انسولین رنج می برند. همچنین تخمین زده شده است که در آینده ای نزدیک تعداد افراد مبتلا به دیابت دو برابر خواهد شد. همراه با افزایش تعداد بیماران دیابتی در دنیا، افزایش تقاضا برای هورمون انسولین (با رشد 3 الی 4 % در سال) قابل پیش بینی است. روبرو شدن با این میزان تقاضا، توسع? روش های ارزان، مقرون به صرفه و با ظرفیت تولید بالا را برای آینده ضروری می نماید. با توجه به پتانسیل بالای گیاهان برای تولید زیست داروها، با بهره گیری از زراعت مولکولی(mulecular farming) تولید و عرض? انسولین با استفاده از گیاهان نیز می تواند چشم انداز نوید بخشی باشد.به همین منظور، در این تحقیق انتقال ژن پروانسولین انسانی به گیاه خیار مورد بررسی قرار گرفت. مهمترین مرحله در انتقال ژن بدست آوردن باززایی موفق از گیاه است، بنابراین نهادینه شدن کشت بافت خیار اولین گام در انتقال ژن پروانسولین به آن است. با توجه به نبود هیچ گزارشی در مورد باززایی و کشت بافت ارقام خیار ایرانی، در این تحقیق ابتدا کشت بافت و باززایی مستقیم خیار واریت? اصفهان، با آزمون 40 تیمار هورمونی مختلف، نهادینه شد. به منظور انتقال ژن، از باکتری اگروباکتریوم، سوی? lba4404 دارای ناقل pcambia1304 حاوی ژن پروانسولین تحت کنترل پیشبرند? camv 35s، استفاده شد. جهت انتقال ژن، ریزنمونه های کوتیلدونی با اگروباکتریوم تلقیح شده و پس از هم کشتی، به محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک منتقل شدند. جوانه های باززایی شده در محیط کشت انتخابی، جهت افزایش رشد ساقه و ریشه زایی به محیط کشت دیگری منتقل شدند. گیاهچه های تراریخت حاصل، پس از سازگاری با محیط، به گلدان و گلخانه منتقل شدند. گیاهان خیار تراریخت پس از طی مراحل رشدی، ابتدا تولید گل و سپس میوه نمودند. بذرگیری از میوه های گیاهان تراریخت به منظور آنالیز آن ها در نسل دوم، صورت پذیرفت. آنالیز گیاهان تراریخت خیار در سه سطح dna، rna و پروتئین انجام شد. آنالیز در سطح dna به روش آزمون pcr، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد و بدین ترتیب، با تکثیر ژن پروانسولین، تراریختی گیاهان تأیید شد. به منظور بررسی بیان ژن پروانسولین منتقل شده به خیار، با استخراج rna از گیاهان تراریخت و شاهد و استفاده از آزمون rt-pcr ، بیان ژن پروانسولین در سطح rna به تأیید رسید. به منظور آنالیز بیان پروتئین، از سه روش sds-page ، دات بلات و لومینسانس الکتروشیمیایی (electrochemiluminescence) استفاده شد. در نتایج حاصل از بررسی در سطح پروتئین، حضور و بیان پروتئین نوترکیب پروانسولین در گیاه تراریخت نیز تأیید شد.

در دهه های اخیر، پیشرفت در زمینه بیوتکنولوژی گیاهی، بویژه زراعت مولکولی (molecular farming) امکان استفاده از گیاهان را به عنوان یک سیستم مناسب جهت تولید بخشی از پروتئین های نوترکیب فراهم کرده است. در این زمینه، مهندسی ژنوم کلروپلاستی به دلیل داشتن مزایای زیاد راهکاری موثر جهت تولید پروتئین های نوترکیب می باشد. تقاضا برای تولید پروتئین های نوترکیب جهت مصارف تشخیصی و درمانی به سرعت رو به گسترش است. یکی از پروتئین های ارزشمند دارویی، اینترفرون گامای انسانی می باشد که کاربردهای پزشکی وسیعی در زمینه های تشخیصی و درمانی دارد. ژن اینترفرون گامای انسانی به همراه ژن مقاومت به اسپکتینومایسین - استرپتومایسین، توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس و با استفاده از ناقل کلروپلاستی pkczساخته شد و به روش تفنگ ژنی به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافت. هدف از انجام این تحقیق در ادامه تحقیقات قبلی، بررسی پایداری بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در گیاهان ترانس پلاستومیک نسل اول توتون بود. به منظور دست یابی به گیاهان تراریخته نسل اول (t1)، ابتدا بذور جمع آوری شده از گیاهان t0به همراه بذور شاهد ضدعفونی شده و سپس بر روی محیط ms حاوی آنتی بیوتیک) اسپکتینومایسین و استرپتومایسین) مورد آزمون قرار گرفتند. گیاهان رشد نموده در سطح محیط انتخابگر، به منظور تائید درج و بیان ژن هدف در کلروپلاست گیاه توتون در سطوح مختلف (dna، rna و پروتئین) مورد آنالیز قرار گرفتند. بررسی گیاهان مورد آزمایش در سطح dna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن اینترفرون گاما و روش pcr صورت پذیرفت و درج این ژن را در ژنوم کلروپلاستی گیاهان مورد بررسی تایید کرد. با آزمون rt-pcr نسخه برداری و بیان ژن هدف (اینترفرون گامای انسانی) در گیاهان ترانس پلاستومیک تایید شد. همچنین به منظور اثبات بیان ژن هدف در سطح پروتئین و تعیین میزان بیان ژن اینترفرون گامای انسانی، آزمون های sds-page، بلات نقطه ای، وسترن بلات و الیزا انجام شد. آزمون سادرن بلات نیز هموپلاسم بودن گیاهان نسل اول (t1) را تایید کرد.

چکیده: آنزیم لوسیفراز عامل اصلی پدیده بیولومینسانس یا نشر نور توسط موجودات زنده است. بیولومینسانس به فرآیند تبدیل انرژی شیمیایی به نور در سیستمهای زیستی گفته میشود و به دو جزء اصلی یعنی آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین بستگی دارد. این فرایند در دسته وسیعی از جانداران آبزی و خشکیزی مشاهده و گزارش شده است. آنزیمهای درگیر در این فرایند با نام کلی لوسیفراز نامگذاری شده اند. واکنش آنزیمها عموماً منجر به تولید نور سبز- زرد می شود . به دلیل کاربرد فراوان لوسیفراز حشره شبتاب، بیشتر مطالعات بر روی این آنزیم صورت گرفته است. این آنزیم با استفاده از atp و mg2+ ،o با انجام عمل اکسیداتیو، دکربوکسیلاسیون بر روی سوبسترای –d لوسیفرین، نور سبز- زرد و نیز آدنوزین مونوفسفات co2 (amp) اکسی لوسیفرین و پیروفسفات (ppi) تولید می کند . ژن لوسیفراز به عنوان ژن گزارشگر بسیار حساس، کاربرد فراوان دارد. به طور معمول، تولید لوسیفراز نوترکیب عمدتاً به سیستمهای میکروبی وابسته است. لوسیفراز نوترکیبی که در این سیستم ها بیان میشود، به دلیل ماهیت پروکاریوتی سیستم بیانی باکتریها، فاقد خصوصیات مطلوب آنزیمی و پایداری مناسب می باشد، اما فرآیندهایی نظیر تشکیل باندهای دی سولفیدی ، تاخوردگی و گلیکوزیلاسیون در سیستمهای بیان گیاهی به طرز صحیح صورت می گیرد. همچنین فرمهای تجاری موجود این آنزیم، بسیار گرانقیمت بوده و استفاده از آنها مقرون به صرفه نیست. امروزه ژنهای گزارشگر نقش بسیار مهمی در مهندسی ژنتیک دارد. برای بهینه سازی ژن لوسیفراز جهت بیان مناسب در گیاه سعی در حذف و تغییر چندین نوکلئوتید در ژن خواهد شد. بدین منظور پرایمرهای تخصصی با استفاده از نرم افزارهایgene runner , oligo analyzer و genious طراحی شده و برای افزایش بیان ژن در گیاه تمهیداتی نظیر اضافه کردن توالی کزاک همچنین حذف توالی پراکسی زومی از انتهای ژن و ... در نظر گرفته شد . در این پژوهش ژن لوسیفراز که بر اساس ترجیح کدونی برای سلولهای گیاهی به صورت codon optimize شده توسط شرکت promega سنتز شده بود بعد از اعمال تغییرات به وسیله پرایمرها با تکثیر از طریق pcr با آغازگرهای اختصاصی در ناقل ویروس کلون شد. و سپس با روش saat به سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 منتقل شدند. برای تهیه سلولهای سوسپانسیونی توتون واریته ایرانی or 209 ابتدا بذرها شستشو داده شد و سپس در محیط ms بدون هورمون کاشته شد بعد از گرفتن گیاه کامل برگها به محیط القا کالوس منتقل شدند سپس کالوسها را به محیط مایع ls جهت جدا شدن سلولهای کالوس از یکدیگر منتقل شد. ناقل کلون شده را با استفاده از روشهای ذکر شده به این سلولها منتقل نموده و سپس با استفاده از دستگاه لومینومتر مقدار فعالیت این آنزیم در گیاه به صورت in vivo اندازه گیری شد.

بالا بودن هزینه درمان باعث شده سازمان بهداشت جهانی به دنبال سیستم هایی باشد که از گیاهان دارویی برای تهیه دارو استفاده شود. نعناع فلفلی (mentha piperita) یک گیاه دارویی چند ساله است که مواد موثره آن برای درمان سرطان پروستات و کبد، عفونت حاد دستگاه تنفسی و آلرژی، مشکلات گوارشی، درد های عصبی، میگرن و ... بکار می رود. در این تحقیق با هدف افزایش منتول، بیان ژن های مهم (pr, mfs, ls) مسیر بیوسنتز منتول، تغییر در خصوصیات فیزیولوژیکی-بیوشیمیایی، ترکیبات اسانس در پاسخ به متیل جاسمونات meja)) و همچنین بیان این ژن ها در اندام های مختلف گیاه بررسی شد. در زمان شروع مرحله گلدهی، بوته ها با غلظت های مختلف meja (mm 5/0, 1/0, 0) محلول پاشی شده و نمونه برداری در زمان های مختلف انجام شد. تغییرات تشخیص داده شده در صفات فیزیولوژیکی - بیوشیمیایی از جمله افزایش فعالیت دو آنزیم آنتی اکسیدان پراکسیداز (pox) و سوپراکسید دیسموتاز (sod) نشان داد که بعد از تیمار با meja مسیر های سیگنالی تولید رادیکال های آزاد (ros) و اسید جاسمونیک (ja) فعال شده و این مسیر های سیگنالی بیان ژن های مسیر تولید منتول و شاخه انشعابی این مسیر یعنی تولید منتوفوران را تحت تأثیر قرار داده اند. احتمالاً این مسیر های سیگنالی با فعال کردن فاکتورهای نسخه برداری (tfs) مشترک باعث تغییر بیان ژن های مورد مطالعه مسیر تولید منتول می شوند. استنتاج می شود که دو ژن pr و mfs ژن های مهمی در پاسخ به meja بوده و کاندیدای مناسبی برای مهندسی متابولیت هستند. همچنین بیان ژن های mfs و pr در اندام های مختلف در سطح نسخه برداری کنترل می شوند. بهترین ترکیب اسانس با منتول بالا درh 96 پس از محلول پاشی meja با غلظت mm 1/0 بدست آمد و مشخص شد که این تیمار علاوه بر افزایش منتول، ترکیبات مفید دیگری مثل لینالول و 1، 8-سینئول که ارزش دارویی بالایی دارند، را نیز افزایش می دهد.

گیاهان یک جایگزین مناسب برای سیستم های معمول بیان پروتئین های نوترکیب، نظیر حیوانات یا سیستم های میکروبی می باشند. در زراعت مولکولی علاوه بر بیان موقت ژن (های) هدف می توان آنها را به هسته یا کلروپلاست سلول گیاهی منتقل کرد. به دلیل پلی پلوئیدی ژنوم پلاستیدهای گیاهی، در صورت تراریختی کلروپلاست، هزاران کپی از ژن هدف در هر سلول وارد و حجم بسیار بالایی از پروتئین نوترکیب در این اندامک ها تولید می شود. بیماری های قلبی- عروقی سومین عامل مرگ و میر انسانی هستند. پروتئین انسانی tpa (tissue plasminogen activator) یکی از مهم ترین پروتئین های نوترکیب داروئی است که به منظور از بین بردن لخته خون در بخش های مختلف بدن از جمله رگ های خون رسان به قلب و مغز استفاده می شود. فرم اصلاح شده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر، قدرت نفوذ در لخته و فعالیت تجزیه فیبرین بالاتر می باشد. در این پروژه تحقیقاتی، به منظور انتقال ژن k2s به کلروپلاست گیاه توتون،cdna مربوطه پس از تکثیر به کمک pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، در ناقل t/ptz57r درج و همسانه سازی شد. پس از اطمینان از صحت چارچوب بازخوانی ژن از طریق توالی یابی، قطعه هدف در ناقل کلروپلاستی pkcz خاص گیاه توتون درج و در باکتری e. coli سویه dh5? همسانه سازی شد. جهت تسهیل تخلیص محصول پروتئین تولیدی از طریق کروماتوگرافی، توالی شش هیستیدین و توالی پروتئازی فاکتور xa به انتهای آمینی ژن k2s الحاق شد. ناقل حامل ژن هدف با استفاده از روش زیست پرتابی، به ریزنمونه های برگی شلیک شد. سپس ریزنمونه های دریافت کننده ژن به منظور انتخاب سلول های تراریخته بر روی محیط گزینش گر حاوی 500 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین قرار گرفتند. پس از باززایی جوانه های تراریخته، به منظور رسیدن به هموپلاسمی، زیرکشت های متعدد و حداقل سه دوره باززایی نوساقه در حضور آنتی بیوتیک گزینش گر انجام شد. حضور و تلفیق تراژن k2s در گیاهان ترانس پلاستومیک با آنالیز pcr و هموپلاسمی به کمک کاوشگرهای طراحی شده و آزمون دورگه سازی به روش سادرن به تایید رسید. ارزیابی بیان ژن هدفk2s و میزان پروتئین تولیدی با آنالیز rt-pcr، sds-page، لکه گذاری نقطه ای، وسترن بلات و الایزا انجام شد. فعال بودن پروتئین تولید شده در گیاهان تراریخته با آزمون زیموگرام تایید شد. پروتئین tpa تولیدی در گیاهان ترانس پلاستومیک توتون، با ستون نیکل و روش کروماتوگرافی میل ترکیبی به فلز، تخلیص شد. حضور پروتئین tpa (فرم k2s) در نمونه های حاصل تخلیص پس از وسترن بلات، مورد تایید قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که میزان پروتئین tpaتولید شده در کلروپلاست به طور قابل ملاحظه ای نسبت به گزارشات قبلی بیان پروتئین tpaدر هسته گیاه افزایش داشته است و اندامک کلروپلاست به عنوان یک بیوراکتور طبیعی از پتانسیل خوبی جهت بیان tpa برخوردار است.

کشاورزی مولکولی شاخه جدیدی از بیوتکنولوژی گیاهی است که در آن گیاهان برای تولید پروتئین های نوترکیب دارویی و صنعتی در حجم زیاد مهندسی می شوند. یکی از تکنیک های مورد استفاده در کشاورزی مولکولی انتقال ژن به کلروپلاست به جای هسته در گیاهان می باشد که موجب شده است عملکرد و کیفیت پروتئین های تولید شده در گیاهان بهبود یابد و سیستم گیاهی را به یک سیستم تولید کم هزینه و کم خطر تبدیل نماید. استفاده از این تکنیک به دلیل مزایای زیاد احتمالا جوابگوی نیاز روز افزون به پروتئین های دارویی به ویژه در کشور های در حال توسعه خواهد بود. در این تحقیق، هدف امکان سنجی بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در کلروپلاست گیاه توتون بود. اینترفرون گاما یکی از پروتئین های دارویی با ارزش در علم پزشکی است و در درمان سرطان ها و بیماری های عفونی کاربرد دارد. به منظور تولید این پروتئین در کلروپلاست، ژن اینترفرون گاما در ناقل کلروپلاستی pkcz ، بین پیشبرنده prrn و نشانگر گزینشی aada همسانه سازی شد. سپس برگهای توتون در شرایط استریل به وسیله ناقل حاوی اینترفرون گاما متصل به ذرات طلای 0/6 میکرونی با استفاده از سیستم بایولیستیک بمباران شدند. ریز نمونه های بمباران شده به محیط کشت rmop حاوی mg/l500 اسپکتینومایسین منتقل شدند. بعد از گذشت چند هفته گیاهچه های مقاوم به آنتی بیوتیک باززا شدند. این گیاهچه ها بعد از اینکه به حد کافی رشد کردند در محیط کشت ms حاوی اسپکتینومایسین ریشه دار شدند. گیاهان مقاوم در سطح dna، rna و پروتئین آنالیز شدند. نتایج آنالیزها در سطح dna نشان داد که ژن اینترفرون گاما در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاست درج شده است سپس هموپلاسمی در گیاهان تراریخت کلروپلاستی با آزمون سادرن بلات تایید شد. رونویسی ژن اینترفرون گاما به وسیله تکنیک rt-pcr اثبات شد و بررسی بیان اینترفرون گاما به وسیله sds-page، آزمون دات بلات و وسترن بلات، تولید پروتئین اینترفرون گاما را در کلروپلاست نشان داد. نهایتا اندازه گیری میزان پروتئین اینترفرون گاما در برگ گیاهان تراریخت با آزمون elisa نشان داد که میزان بیان آن تقریبا 0/2% از کل پروتئین محلول در برگ می باشد که در مقایسه با تراریخت های هسته ای بسیار بالاتر می باشد اما به دلیل نیمه عمر پایین و تجزیه آن در کلروپلاست، میزان آن کمتر از تراریخت های کلروپلاستی می باشد.

تولید پروتئین نوترکیب در گیاه به دلیل برخورداری از مزایای متعدد از قبیل هزینه تولید بسیار پایین و پتانسیل تولید پروتئین نوترکیب بالا از اهمیت بالایی برخوردار است. بیماری های قلبی و عروقی عامل مرگ و میر بسیاری در سطح جهان می باشند. پروتئین tpa یک پروتئین است که به صورت طبیعی در بدن تولید می شود و منجر به تجزیه لخته های خونی در بدن می شود؛ اما در بیماران قلبی و عروقی نیاز به سطح بالایی از پروتئین به منظور تجزیه لخته خونی که باعث انسداد عروق شده اند، می باشد تا لخته خونی در زمانی سریع قبل از آسیب جدی به بیمار تجزیه شود. بنابراین تولید این پروتئین به صورت نوترکیب از اهمیت بسزایی برخوردار است. در این تحقیق گیاهان ترانسپلاستومیکس حاوی ژن tpa نسل t1 مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی در سطوح مختلف dna، rna و پروتئین با استفاده از روش های مختلف انجام گرفت تا پایداری ژن منتقل شده به کلروپلاست گیاهان در نسل t1 مورد ارزیابی قرار گیرد. بررسی در سطح dna وجود ژن مورد نظر در ژنوم کلروپلاست گیاهان را تایید نمود. همچنین بررسی در سطح rna بیان ژن مورد نظر را تایید نمود. در بررسی در سطح پروتئین از روش های مختلف استفاده شد. روش دات بلات و sds-page نتوانستند تولید پروتئین در گیاهان مورد بررسی را نشان دهند؛ اما بررسی توسط آزمون وسترن بلات تولید پروتئین با اندازه مورد نظر را در گیاهان نشان داد. در ادامه میزان تولید پروتئین با استفاده از آزمون الایزا مورد سنجش قرار گرفت که حداکثر میزان تولید پروتئین در پروتئین های محلول کل گیاه (tsp) %0/13 محاسبه شد.

گیاهان به دلیل تولید پروتئین نوترکیب با هزینه پایین، تولید انبوه و ایمنی بالا، به عنوان جایگزین مناسبی برای سیستم‏های رایج تولید پروتئین نوترکیبدارویی، بویژه در فرمانتور مطرح می‏باشند.فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tpa) یکی از پروتئین‏های دارویی است که برای حل کردن لخته‏های خونی در سکته‏های قلبی و مغزی کاربرد گسترده ای دارد و به دلیل کمیاب بودن و قیمت بالا در دسترس عموم بیماران نمی‏باشد. گیاهان تراریخت حاوی ژن tpa توسط تیم تحقیقاتی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس تولید شده بود و در این پروژه تحقیقاتی نیز پایداری ژن tpa درنسل دوم گیاهان تراریخته توتون، به منظور امکان‏سنجی و فراهم نمودن مقدمات تولید پروتئین tpa در حجم انبوه مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور بذرهای حاصل از گیاهان تراریختt0با دو سازه pktو pext روی محیط کشت انتخابگر واجدmg l -1 100 کانامایسین کشت شدند سپس روی گیاهان تراریخت، آنالیز pcr و rt-pcr انجام شد و حضور و بیان ژن tpa در گیاهان تراریخت اثبات گردید. از برگ گیاهان تراریخت که دارای بیان ژن tpa، بودند پروتئین کل استخراج و تولید پروتئین هدف با آزمون لکه‏گذارینقطه‏ای اثبات گردید. میزان پروتئین تولیدی با آزمون الایزا برای سازه pkt 023/0% و برای سازهpext 025/0% از پروتئین محلول کل (tsp)تعیین گردید. با انجام آنالیزهای آماری بین گیاهان واجد دو سازه‏ اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد ولی گیاهان تراریخت با دو سازه در مقایسه با گیاه شاهد با آزمون lsd در سطح احتمال95% اختلاف معنی‏داری داشتند. برای تایید بیشتر، آزمون وسترن‏بلات انجام شد، قطعه‏های kda32-21 مشاهده گردید. نتایج بدست آمده نشان دادند که پایداری ژن در گیاهان تراریخت نسل دوم 70% و پایداری بیان 80%می‏باشد، هم چنین میزان تولید پروتئین افزایش یافت اما به علت فعالیت پروتئازها به قطعه‏های کوچکتر شکسته شد

فعال کننده پلاسمینوژن یک سرین پروتئاز است که نقش مهمی در سیستم فیبرینولیتیک و انحلال لخته های فیبرین دارد و در کبد تولید می شود. در افرادی که دچار سکته های قلبی یا مغزی می شوند این پروتئین یا تولید نمی شود و یا میزان تولید آن خیلی کم است به طوریکه نمی تواند لخته های خونی را حل و از بین ببرد. با تزریق این دارو در بیمارانی که دچار سکته قلبی و مغزی شده اند در فاصله زمانی مناسب پس از حمله، می توان مریض را از مرگ حتمی نجات داد. این دارو در حال حاضر به صورت وارداتی به کشور ایران وارد می شود. پروتئین های بیگانه ای که در گیاهان بیان می شوند ساختار اصلی خود را حفظ می کنند بنابراین گیاهان تراریخت برای تولید پروتئین هائی با ارزش دارویی جایگزین مناسب به شمار می روند. فعال کننده پلاسمینوژن نوترکیب یک پروتئین محلول است که در گیاهان بخصوص توتون تولید می شود. در این تحقیق، از گیاهان توتون تراریختی که توسط گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس تولید شده بودند، استفاده گردید. جهت بررسی بیان ژن در گیاهان تراریخت و اطمینان از تراریخت بودن آنها، dna و rna ژنومی از برگ های گیاه توتون تراریخت استخراج و جهت تایید حضور ژنt-pa ، آزمایش pcr و rt-pcr انجام گرفت که گیاهان تراریخت در مقایسه با شاهد باندهای مورد انتظار را نشان دادند. سپس پروتئین محلول از برگهای گیاه توتون تراریخت استخراج و نمونه ها با استفاده از آزمایش sds-page آنالیز شدند.

فلزات سنگین ماهیتی سمی و غیر قابل تجزیه دارند و راه یافتن آنها به منابع آبی در جریان فعالیتهای صنعتی، همواره به عنوان یک تهدید و معضل زیست محیطی مطرح بوده است. یکی از راه های موثر حذف این آلودگی، استفاده از روش های زیستی است و جلبک ها با قابلیت های ویژه خود می توانند به عنوان کاندیدای مناسبی برای این منظور قلمداد شوند. استفاده از تکنولوژی و ابزارهای مهندسی ژنتیک برای ارتقای قابلیت جلبک ها در این زمینه بسیار مفید به نظر می رسد. با هدف ارتقای قابلیت جلبک کلرلا در جذب فلزات سنگین، ژن سنتتیک متالوتیونین، که محصول آن پپتیدی با قابلیت جذب فلزات سنگین است، در وکتور گیاهی pbi121 کلون گردید و با استفاده از روش الکتروپوریشن به این جلبک انتقال داده شد. پس از تایید انتقال و بیان این ژن با روش های pcr و , rt-pcr به بررسی مقاومت این جلبک در محیط های آلوده به کادمیم پرداخته شد. نتایج نشان داد جلبک تراریخته می تواند در محیط های کشت جامد f/2(شوری 25 درصد) غلظت g/mlµ 600 از ترکیب (cd2o12s3.8h2o) حاوی فلز سنگین کادمیم را تحمل کند که این مقدار g/mlµ 100 بیش از توانایی جلبک غیر تراریخته است. همچنین بررسی ها نشان داد بیان این پپتید در جلبک کلرلا باعث جذب فلز سنگین کادمیم از یک محیط مایع آلوده بهcd+2 ppm67 به میزان ppm 49 و تقلیل آن به ppm18در طی یک دوره رشد 21 روزه می گردد، در صورتی که در همان شرایط،جلبک غیر تراریخته تنها توانایی جذب ppm 12 از کادمیم را دارا بود.

اسید فولیک جزء ویتامین¬های ضروری بوده و نقش کلیدی در بدن ایفا می¬کند. این ویتامین توسط حیوانات و بشر سنتز نمی¬گردد. به طور عمده غذاهای گیاهی منبع این ویتامین می¬باشند. این مطالعه به منظور انتقال ژن gchi به گیاه کاهو و اسفناج با هدف افزایش اسید فولیک در این دو گیاه صورت گرفت. از ریزنمونه¬ها¬ی سه روزه¬ی کوتیلدون، هیپوکوتیل، کوتیلدون + هیپوکوتیل گیاه کاهو و از ریزنمونه¬های ده روزه¬ی هیپوکوتیل و کوتیلدون و ریشه¬چه و ریزنمونه¬ی 30 روزه¬ی برگ گیاه اسفناج به منظور باززایی و انتقال ژن استفاده گردید. نتایج نشان داد بیشترین درصد باززایی مستقیم کاهو از ریزنمونه¬ی کوتیلدون + هیپوکوتیل در محیط ms حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و بدون تنظیم¬کننده¬های رشد به دست آمد. همچنین بیشترین درصد باززایی در اسفناج از ریزنمونه¬ی ریشه-چه در محیط ms½ محتوی 30 گرم در لیتر ساکارز، 10 میکرومولار naa و 1/0 میکرومولار ga3 به دست آمد. آنالیز داده¬ها با استفاده از spss و بر اساس طرح فاکتوریل بر پایه¬ی تصادفی صورت گرفت. در این آزمایش اثر زمان هم¬کشتی و استقرار بر روی کالوس¬زایی، جنین¬زایی و ساقه¬زایی ریزنمونه¬های تراریزش شده با اگروباکتریوم مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز گیاهان نوترکیب و شاهد به وسیله¬ی pcr انجام شد. بدین منظور dnaی ژنومی از برگ¬های جوان کاهو استخراج گردید. آنالیز pcr حضور ژن gchi را با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن مورد نظر در گیاه کاهو تایید کرد. بهترین نتیجه از تیمار قرارگیری ریزنمونه در محیط استقرار به مدت 2 روز و در محیط هم¬کشتی به مدت 4 روز به دست آمد. در هر دو گیاه مورد آزمایش (کاهو و اسفناج) ریزنمونه¬هایی که بلافاصله پس از جدا شدن از گیاهچه با مایع تلقیح آلوده شده بودند پس از چند روز زرد شده و از بین رفتند. کمترین درصد گیاهان تراریخت از تیمار قرارگیری ریزنمونه در محیط استقرار به مدت 6 روز و 1 روز در محیط هم¬کشتی به دست آمد. بذر¬های گیاهان نوترکیب کاهو در محیط ½msحاوی کانامایسین کشت گردید و استخراج dna از برگ¬های آنها صورت گرفت. نتایج pcr انتقال این ژن به نسل t1 گیاه کاهو را نیز تایید کرد. در گیاه اسفناج باززایی فقط در ریزنمونه¬ی ریشه¬چه صورت گرفت و باززایی در محیط حاوی آنتی بیوتیک¬های کانامایسین و سفتریاکس نشان دهنده¬ی این است که به احتمال زیاد ژن مورد نظر به اسفناج نیز منتقل گردیده است.

داروهای گیاهی نقش مهمی در درمان بسیاری از بیماری‏ها از جمله‏ سرطان دارند . در میان آنها، تاکسول یکی از مهم ترین و موثرترین داروهای ضد سرطانی است که تاکنون شناسایی شده است. کشت سلول و بافت گونه‏های سرخدار (taxus spp.)، و به تازگی فندق (corylus avellana l.)، از امیدبخش‏ترین روش‏ها، برای تولید انبوه و ارزان این ترکیب می‏باشد. به منظور افزایش میزان این داروی ارزشمند در فندق عوامل و فاکتورهای مختلف از جمله تاثیر نوع منبع کربن محیط کشت، پیش‏ماده، الیسیتور و همچنین بررسی القاء پلی‏پلوئیدی در کشت سوسپانسیون سلولی آن مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور، در آزمایشی، از 4 نوع ترکیب قندی در ترکیب با فنیل‏آلانین به عنوان پیش‏ماده در سه سطح و وانادیل سولفات به عنوان الیسیتور در سه سطح استفاده شد. اثر این ترکیبات تیماری روی صفات درصد زنده مانی، وزن تر سلول‏ها و میزان تاکسول درون سلولی، در روزهای 6 ، 8 و 10 دوره کشت بررسی شدند. در آزمایش دیگری، جهت القای پلی‏پلوئیدی، اثر غلظت‏های کلشیسین در مدت زمان‏های مختلف بررسی شدند. در نهایت، اثر عوامل فوق بر بیان دو ژن ggpps و pal به روش qrt-pcr مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که درصد زنده‏مانی سلول‏ها با افزایش مقادیر فنیل‏آلانین و وانادیل‏سولفات کاهش می‏یابد و بیش ترین درصد زنده مانی توسط شاهد و کم‏ترین‏ آن با استفاده از µm 3 از فنیل‏آلانین و mm 1/0 از وانادیل سولفات در روز دهم دوره کشت بدست آمد. همچنین بیش ترین مقدار وزن‏ تر، در روز دهم دوره کشت، توسط محیط کشت حاوی 3% گلوکز فاقد فنیل‏آلانین و وانادیل سولفات؛ و کم‏ترین‏ مقدار توسط محیط کشت حاوی 3% گلوکز حاوی µm 3 از فنیل‏آلانین و mm 1/0 از وانادیل سولفات بدست آمد. نتایج نشان داد که بیش ترین میزان تاکسول در روز دهم دوره کشت، توسط محیط کشت حاوی 3% فروکتوز، µm 3 از فنیل‏آلانین و mm 05/0 و 1/0 از وانادیل سولفات بدست آمد. همچنین بررسی اثرات مقادیر مختلف فنیل‏آلانین و وانادیل سولفات بر بیان ژن ‏های مورد نظر نشان داد که بیان ژن pal، تحت تأثیر فنیل‏آلانین (µm 3) و وانادیل سولفات (mm 05/0) به طور معنی‏داری افزایش یافته، در حالی که این مواد تاثیر معنی‏دار روی بیان ژن ggpps نداشتند. همچنین بر اساس نتایج فلوسیتومتری، کالوس تتراپلوئید توسط تیمارهای 2/0% کلشیسین به مدت 5 روز در محیط کشت جامد و نیز 3/0% کلشیسین به مدت 4 روز در محیط کشت مایع بدست آمد. بررسی اثر تتراپلوئیدی در میزان تاکسول نشان داد که تتراپلوئیدی موجب افزایش تاکسول شده است و بیان ژن ggpps را به طور معنی دار افزایش داده است. به طور کلی عوامل مورد بررسی در این پژوهش، باعث افزایش میزان تاکسول در کشت سوسپانسیون سلولی فندق شده است، که دستاورد امید بخشی جهت تولید تاکسول از منبعی غیر از گیاه سرخدار می‏باشد.

فسفر به عنوان یکی از ضروری ترین عناصر موثر در رشد و نمو گیاهان، از اجزای اصلی ساختمان تشکیل‏دهنده مولکول های زیستی از جمله اسیدهای نوکلئیک و فسفولیپید ها محسوب می شود و در واکنش های حیاتی گیاه از جمله تنفس و فتوسنتز نقشی اساسی ایفا می کند. با این حال غلظت فسفات قابل جذب توسط ریشه گیاهان در خاک حدود 1 تا 10 mµ بوده و غلظت یون فسفات در سلول‏ها‏ی گیاهی بین 5 تا 20 mm است. به همین دلیل فسفر عنصر محدود کننده رشد و نمو گیاهان و به دنبال آن محصولات کشاورزی در زمین های قابل کشت است. در مطالعه حاضر با هدف رفع محدودیت فسفر گیاهان و توانمند نمودن آن ها در جذب و به چرخش در آوردن فسفر، عملکرد atpap17، یکی از ژن های اسیدفسفاتاز ارغوانی گیاه آرابیدوپسیس تالیانا که در خلال تنش کمبود فسفات بیان فراوانی دارد، مورد بررسی واقع شد. به منظور بررسی عملکرد ژن atpap17، cdna ژن مذکور در سازه ی parm2 تحت پیش برنده camv-35s به روشfloral dip و vaccum infiltration به گیاهان آرابیدوپسیس تالیانا منتقل شدند که پس از غربالگری گیاهان تراریخت احتمالی در محیط انتخابی (حاوی آنتی‏بیوتیک کانامایسین) و تایید نهایی با استفاده از آغازگر های اختصاصی، تعداد 19 ژنوتیپ بیش بیان که 12 ژنوتیپ از این مجموعه دارای یک نسخه از ژن درج شده در ژنوم، 3 ژنوتیپ دارای دو نسخه درج شده در دو کروموزوم مختلف و 4 ژنوتیپ دارای دو نسخه درج شده به صورت cis بودند، شناسایی شدند و با گیاهان جهش یافته دارای درج t-dna در ژن atpap17 و همچنین گیاهان طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا در دو شرایط فاقد فسفات و فسفات کافی (به ترتیب صفر و mm 2/1 فسفر) مورد مقایسه واقع شدند. نتایج حاکی از افزایش معنی دار 7/23 % فعالیت فسفاتازی گیاهان بیش بیان و همچنین کاهش معنی دار 4/71 % گیاهان جهش یافته نسبت به گیاهان طبیعی در محیط واجد فسفات بود. همچنین بیشترین مقدار فسفات آزاد در شرایط فسفات کافی مربوط به گیاهان بیش بیان با 4/111 % افزایش و کمترین مقدار آن مربوط به گیاهان جهش یافته با 8/37 % کاهش نسبت به گیاهان طبیعی مشاهده گردید. این نتایج حاکی از نقش کلیدی ژن atpap17 در شبکه ژنی حفظ هموستازی فسفر در جهت آزادسازی و چرخش فسفر آزاد از منابع فسفر خارج سلولی (محیط اطراف ریشه) و همچنین موثر در تعیین ساختار و گسترش ریشه در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا می باشد.

بشر در طی سالیان، به منظور غلبه بر مشکلات ناشی از افزایش جمعیت خود و تولید روز افزون مواد غذایی، دستکاری های ژنتیکی زیادی در گیاهان انجام داده است. در این پژوهش تأثیر این تغییرات بر سطوح سه گانه تغذیه ای گیاه- گیاهخوار- پارازیتوئید مورد بررسی قرار گرفت. تاثیر گیاهان مختلف کروسیفر که از نظر میزان این دستکاری ها با هم متفاوت بودند، شامل جد وحشی کلزا brassica rapa l.، 2 رقم زراعی کلزا opera و rgs003، رقم هیبرید hyula401، و 2 لاین موتانت rgs003 و تراریخت pf کلزا بر پارامترهای زیستی بید کلم plutella xylostella l. (lepidoptera: plutellidae) و زنبور پارازیتوئید diadegma semiclausum helen (hymenoptera: ichneumonidae) در اتاق رشد با دمای 1±25 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 5±60 درصد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی مورد بررسی قرار گرفت. میزان گلوکوزینولات ها به عنوان شاخصی از دفاع شیمیایی گیاهان میزبان اندازه گیری شد. نتایج آزمایشات نشان داد که بیشترین کارایی بید کلم و زنبور پارازیتوئید روی گیاهانی با میزان گلوکوزینولات-های بالاتر (جد کلزا و ارقام زراعی) می باشد. بیشترین و کمترین نرخ ذاتی افزایش جمعیت(r) بید کلم به ترتیب روی رقم زراعی opera (0/236 بر روز) و لاین تراریخت (0/071 بر روز) گزارش شد. در تمامی گیاهان مورد مطالعه، میزان گلوکوزینولات ها پس از تغذیه بید کلم به طور معنی داری افزایش یافت. بیشترین مقدار گلوکوزینولات ها پس از تغذیه گیاهخوار در جد کلزا (29/33 میکرومول بر گرم) برآورد گردید. به طور کلی بید کلم روی لاین های موتانت و تراریخت طول دوره نابالغ طولانی تر، باروری و بقای کمتری نسبت به بقیه گیاهان داشت. مقایسه پارامترهای زیستی و ساختاری زنبور پارازیتوئید روی گیاهان مورد مطالعه نشان داد که این پارازیتوئید روی ارقام زراعی باروری و پارازیتیسم بیشتری نسبت به سایر گیاهان داشته است. از طرفی وزن شفیره ها و حشرات ماده زنبور پارازیتوئید روی این گیاهان بیشتر از بقیه گزارش شد. نرخ متناهی پارازیتیسم(ω) برای زنبور پارازیتوئید مورد مطالعه روی گیاهان مختلف کروسیفر از 0/202 تا 285/ 0(میزبان بر روز) متغیر بود. ظرفیت پارازیتیسم این پارازیتوئید روی ارقام زراعی و جد کلزا بیشترین و روی لاین های موتانت و تراریخت کمترین میزان برآورد گردید. این اطلاعات که چگونه دستکاری های ژنتیکی گیاهان مورد مطالعه و کیفیت گیاه میزبان می تواند بر پارامترهای زیستی این حشره و زنبور پارازیتوئید آن تاثیر بگذارد، کمک شایانی به درک مناسب دینامیسم جمعیت و مدیریت این حشره آفت می کند. همچنین مطالعه حاضر تاثیر دستکاری های انسان را در گیاهان کروسیفر از طریق اهلی سازی و اصلاح نباتات در وضعیت تعاملات این گیاهان با حشرات فعال در سطوح تغذیه ای بالاتر تا حدودی روشن می سازد.

بسیاری از نماتدها دارای زندگی انگلی روی گیاهان میزبانشان هستند و باعث ایجاد خسارات جدی روی محصولات کشاورزی می شوند. توسعه روش های جدید برای کنترل نماتدهای انگل گیاهی از اهمیت شایانی برخوردار است زیرا روش های قدیمی که بر پایه استفاده از نماتدکش ها بودند با نگرانی هایی برای انسان و محیط زیست همراه می باشند. یک روش بینابینی جهت کنترل نماتوهای بیماریزای گیاهی، کنترل آنها توسط دشمنان طبیعی ( کنترل زیستی) می باشد. در بین آنها قارچ های نماتدخوار که گروه اصلی قارچ های خاک زاد محسوب می شوند و آلوده کننده نماتدها هستند، بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. قارچ های تله گذار نماتد arthrobotrys conoides و a. oligospora جزو مهمترین قارچ های نماتدخوار محسوب می شوند.

استراتژی های مختلفی برای افزایش بیان و تجمع پروتئین نوترکیب در گیاهان در نظر گرفته می شود. از مهمترین عوامل موثر بر افزایش میزان تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدف گیری کننده به جایگاههای مناسب در سلول است. بیان پروتئین نوترکیب در بذر، موجب تجمع پایدار آن در غلظت نسبتا بالا در حجم کوچک و فشرده می شود که برای استخراج و ذخیره سازی بسیار مناسب می باشد. از طرف دیگر شبکه آندوپلاسمی سلول بدلیل حضور پروتئینهای چپرونی مختلف و ایزومرازها موجب بسته بندی صحیح پروتئینها شده و پایداری و تجمع پروتئین نوترکیب به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. استراتژی دیگر استفاده از ژن اولئوسین گیاهی به منظور هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می باشد. اتصال ژن اولئوسین به ژن مورد نظر و استفاده از پیشبرنده اختصاصی بذر، موجب قرار گرفتن پروتئین نوترکیب در اجسام روغنی بذر می شود. که علاوه بر تولید زیاد پروتئین، استخراج راحت تر و ارزانتر آن را نیز به دنبال خواهد داشت. در این تحقیق از دو استراتژی مذکور برای بیان پروتئین اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا استفاده شد. برای این منظور 3 نوع سازه مختلف طراحی و ساخته شد: 1) سازه pbi121-ifnγ 1 شامل ژن infγ + پیشبرنده napin، 2) سازه pbi121-ifnγ 2 شامل توالی kdel + ژن infγ + توالی kozak +پیشبرنده napin، 3) سازه pbi121-ifnγ-oleosin شامل infγ + توالی برشی + ژن اولئوسین+ پیشبرنده napin. سازه ها ی مذکور در ناقل گیاهی pbi121کلون و تائید شدند. سپس این سازه ها با روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم سویه lba4404 معرفی و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های لپه ای مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین و سفاتوکسیم) انجام شد. حضور سازه pbi121-ifnγ 2 و pbi121-ifnγ-oleosinدر گیاهان تراریزش شده در سطح dna با استفاده از pcr تائید شد. بررسی در سطح پروتئین با استفاده از sds-page نشان دهنده بیان پروتئین infγ در برخی گیاهان تراریخت شده با سازه pbi121-ifnγ 2 بود. در گیاهان مذکور فعالیت پروتئین تولید شده با تستهای elisa و dot blot و western blot نیز تائید شد. در مورد سازه pbi121-ifnγ-oleosin، علاوه برتائید انتقال سازه در سطح dna ژنومی، بررسی بیان در سطح rna با rt-pcr نشانگر نسخه برداری ژن ترکیبی بود. نتایج حاصل نشان داد که با در نظر گرفتن پروسه های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، بذر گیاه کلزا می تواند بعنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد.