بررسی عملکرد میکرو rnaی اینترونی مصنوعی (ضد) کالومنین بیان شده در 3utr فاکتور 9 انعقادی نوترکیب در رده ی سلولی پستانداران

هموفیلی b یا کریسمس از بیماریهای مسیر انعقادی است که درنتیجه اختلال یا کمبود فاکتور9 حاصل میشود. درمان این بیماری مانند بسیاری از بیماری های سیستمیک دیگر به روش جایگزین درمانی انجام می گیرد. فاکتور 9 در طی مراحل بلوغ خود متحمل برخی تغییرات پس از ترجمه می شود. از جمله این تغییرات کربوکسیله شدن 12 اسید آمینه گلوتامیک اسید است. کربوکسیلاسیون توسط آنزیم گاما کربوکسیلاز در شبکه آندوپلاسمیک انجام می شود. عموما فاکتور 9 انسانی نوترکیب بیان شده در رده های سلولی پستاندار بطور مناسب گاماکربوکسیله نمی شوند. تحقیقات نشان داده است که پروتئین چپرونی بنام کالومنین مهار کننده گاماکربوکسیلاز است. به نظر میرسد که با کاهش بیان کالومنین بتوان بیان فاکتور 9 نوترکیب را در سلول های پستاندار از نظر کیفی و کمی اصلاح نمود. rnai یک راهبرد شناخته شده برای خاموش سازی ژن هاست. در این راستا میکروrna ها (mirna)، به عنوان rna های کوچک غیر کد کننده از جمله مرکزی ترین عوامل تنظیم کننده بیان بسیاری از ژن ها محسوب می شوند. این عمل تنظیمی بر پایه جفت شدن توالی های 2-8 نوکلئوتیدی (ناحیه seed) mirna بالغ با mrna هدف است که موجب سرکوب ترجمه و یا تخریب mrna و در نتیجه کاهش بیان می شود. لذا به نظر میرسد که برای کاهش اختصاصی و دائمی بیان یک ژن ، استفاده ازmirna مصنوعی روش مفیدی باشد. با توجه به نقش باز دارندگی کالومنین بر روی گاماکربوکسیلاز، در این تحقیق یک اینترون نوترکیب دارای mirna مصنوعی (ضد کالومنین) را در پایین دست cdnaی فاکتور 9 قرار داده و تاثیر آن بر بیان ژن کالومنین و همچنین فاکتور 9 نوترکیب در سلول های پستانداران مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق اثر دو sirna ضد کالومنین انسانی که در جایگاه mirna ی بالغ در چارچوب یک mirna ی طبیعی در داخل اینترون 1کوتاه شده فاکتور 9 در موقعیت 3’utr در یک وکتور بیانی جاسازی شده بودند، بر بیان کالومنین و همینطور بیان فاکتور 9 انسانی نوترکیب در یک رده سلولی پستاندار مورد مطالعه قرار گرفت. به این منظور پس از انتقال پلاسمید های نوترکیب به سلول های hek293t ، میزان بیان ژن های کالومنین و فاکتور 9 انسانی با روش real-time pcr و میزان فاکتور 9 نوترکیب بیان شده با الایزا مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده از سلول های ترانسفکت شده با سازه های حاوی mirna ها کاهش بیان کالومنین (ناک دان بیش از 99 درصد) را نشان داد. با بهره گیری از روش pcr با استفاده از پرایمر های stem-loop وجود mirna های بالغ طراحی شده بر ضد کالومنین نشان داده شد. این نتایج نشان داد که mirnaهای مصنوعی از متن اینترون خارج شده و پس از طی مراحل بلوغ عمل مهاری خود بر روی ژن هدف بطور موفق انجام داده اند. بیش بیان فاکتور ? درسلول های دارای سازه اینترون دار در مقایسه با سلول های کنترل مشاهده نشد.