طراحی و ساخت سازه ژنی گزارشگر dual promoter بر مبنای پروموترهای اختصاصی stra8 و c-kit و بررسی عملکرد آن در مسیر باز برنامه نویسی سلول های پیش ساز اسپرمی در مدل موشی

در بسیاری از موجودات پرسلولی، سلول‏های زایا منشا تشکیل موجودات جدید هستند و پایداری و ماندگاری اطلاعات ژنتیکی را در طی نسل‏ها تضمین می‏نمایند. توانایی سلول‏های بنیادی اسپرم ساز به عنوان گروهی از سلول‏های زایا، در فرآیند خود‏‏‏نوزایی و قابلیت تبدیل شدن به سلول‏های بنیادی پرتوان، فرصتی را جهت درمان‏های با مشکلات اخلاقی کمتر و همچنین دستکاری‏های ژنتیکی درجهت تولید حیوانات تراریخته فراهم ‏می‏آورد. بدین ترتیب درک مولکولی سیستم‏های ژنتیکی این گروه از سلول‏ها و افزایش دانش در زمینه زیستی آن‏ها، می تواند در به کارگیری آن‏ها در زمینه‏های پزشکی و درمانی حائز اهمیت باشد. در این مطالعه، یک ناقل لنتی ویروسی dual promoter (fum-m) دارای دو پروموتر اختصاصی در مسیرسلول‏های زایا، به نام‏های stra8 و c-kit، طراحی شد که به ترتیب بیان دو ژن گزارشگر zsgreen و dsred2 را کنترل می‏نمایند. همچنین جهت بهبود عملکرد آن در گزارش شرایط واقعی سلول، مطابق با مطالعات گذشته، توالی‏های کمکی مانند توالی‏های عایق، s/mars و توالی‏های توقف، در این ناقل قرار داده شدند. حضور توالی ژن مقاومت به آنتی‏بیوتیک پیورومایسین، یکی دیگر از ویژگی‏های این سازه می‏باشد که توان انتخاب سلول‏های stra8+ را در بین سایر سلول‏ها به این سازه می‏دهد. در این پژوهش جهت ارزیابی عملگربودن سازه و کارآمد بودن پروموترهای موجود در آن، پس از انتقال سازه به چندین رده سلولی و تایید فعالیت توالی‏های پروموتری و همچنین فعال بودن ساختار لنتی ویروسی آن، قدرت پاسخ‏گویی سازه در حضور تیمارهای مختلفی چون رتینوئیک اسید (ra)، عصاره‏های بیضه موش و خروس، dmso و ریزمولکول chir99021 (به عنوان عاملی موثر در بازبرنامه نویسی سلول) با استفاده از روش‏های فلوسایتومتری و real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت. القا عملکرد هر دو پروموتر stra8 و c-kit موجود در سازه با ra به واسطه حضور توالی های حساس به این ماده در سطح پروموتر و همچنین کاهش عملکرد پروموترها در حضور عصاره‏های بیضه موش و خروس، بیانگر قدرت دینامیکی سازه در شرایط محیطی مختلف بود. از طرفی تطابق پاسخ هر دو پروموتر موجود در سازه با پروموترهای اندوژنوس آن‏ها در حضور dmso و chir99021، توانست صحت طراحی سازه و عملگربودن توالی‏های عایق و دیگر توالی‏های کمکی موجود در سازه را تایید نماید. اما با وجود تایید عملکرد پروموترc-kit طی آزمایش‏های انجام شده، پروتئین گزارشگر dsred2 نتوانست عملکرد مناسبی را در سطح پروتئین نشان دهد و شناسایی آن با میکروسکوپ فلورسنت ممکن نشد که پیش‏بینی می‏شود جایگزین کردن این ژن گزارشگر با انواع دیگر در طی آزمایش‏های تکمیلی در آینده، بتواند در بهبود عملکرد سازه موثر باشد. بنابراین نتایج نشان داد که سازه لنتی ویروسی fum-m توانسته است گزارشی مطابق با شرایط واقعی سلول در اختیار ما قرار دهد و به نظر می‏رسد بهبود ساختار سازه، رفع مشکلات تکنیکی و طراحی آزمایش‏های تکمیلی در آینده، بتواند fum-m را به عنوان ابزاری کاربردی در جهت ردیابی وقایع تکوینی در مسیر سلول‏های زایا معرفی کرده و دیدگاه‏های جدیدی را در طراحی ساختارهای اختصاصی‏تر و با کیفیت بالاتر فراهم آورد.