همسانه سازی ژن آنزیم کلسترول اکسیداز سویه بومی ایرانی rhodococcus sp. ۵۰۲ در راستای تولید آفت کش بیولوژیکی پنبه
چکیده
آنزیم کلسترول اکسیداز بهعنوان نسل جدیدی از آفتکشهای بیولوژیک اثر آفتکشی قوی بر روی آفت غوزه پنبه (heliothis armigera) دارد. مکانیسم اثر کشندگی کلسترول اکسیداز مربوط به اکسیداسیون کلسترول در غشای اپیتیلیوم روده میانی حشرات می باشد که منجر به تخریب فیزیکی و ساختاری غشاء و در نتیجه ایجاد اختلالاتی در عملکرد غشاء و در نهایت سبب مرگ آفت می شود. تولید گیاهان مهندسی ژنتیک شده با ژن کدکننده آنزیم کلسترول اکسیداز در جهت مقاوم سازی آنها به آفات، مستلزم انتخاب مناسب ترین سوش از نظر میزان بیان و فعالیت زیاد این آنزیم است. لذا این تحقیق با هدف همسانه سازی ژن آنزیم کلسترول اکسیداز در یک سیستم بیانی pet مناسب، جهت امکان هدایت پروتئین نوترکیب تولیدشده به فضای پری پلاسمی باکتری طراحی و اجرا شد. بدین منظور از سویه باکتری (rhodococcus sp. 502) بومی ایران، که دارای فعالیت کلسترول اکسیدازی بالا بود، جهت جداسازی ژن با pcr استفاده شد. محصول pcr ابتدا در پلاسمید خطی pjet و در نهایت در پلاسمید pet23a کلون و داخل میزبان (e.coli dh5α) ترانسفورم شد. پس از همسانه سازی و استخراج پلاسمید نوترکیب pet23a+cho و به منظور تأیید حضور ژن از آنزیم های hindiii و xhoi و تعیین توالی استفاده شده است. حضور باند 1600 جفت بازی در هضم آنزیمی حضور ژن را تایید کرد. نتایج حاصل از آنالیز تعیین توالی حاکی از آن است که توالی به دست آمده شباهت زیادی با کلسترول اکسیداز سویه های دیگر باکتری rhodococcusموجود در ncbi دارد، که از آن می توان در راستای تولید آفت کش بیولوژیکی در پنبه استفاده نمود.