مقایسه کارآیی روش های پی سی آر معمولی، nested-pcr، real-time pcr و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه(lamp) در ردیابی عامل بیماری هوآنگ لونگ بینگ مرکبات در ایران*

محمد مهدی فقیهی

چکیده

بیماری هوانگ­لونگ­بینگ (hlb) یا میوه­سبز مرکبات یکی از بیماری های خطرناک مرکبات در دنیا است که اخیراٌ از ایران نیز گزارش شده است. برای انجام مدیریت بهینه بیماری hlb، ردیابی به موقع و سریع بیماری در باغ­های مرکبات امری اجتناب ناپذیر است. به منظور مقایسه کارآیی روش های پی­سی­آر معمولی، nested-pcr، real-time pcr و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه (loop-mediated isothermal amplification) در ردیابی candidatus liberibacter asiaticus، عامل بیماری hlb در ایران، از نمونه­های برگ مربوط به یک درخت پرتقال آلوده و یک درخت سالم استخراج دی­ان­اِی کل انجام شد. سپس در مقادیر مختلف دی ان ای کل ( از 100 نانوگرم تا 1/0 فمتوگرم) از گیاه آلوده و سالم ردیابی عامل بیماری با آزمون پی­سی­آر معمولی (با چهار آغازگر مختلف)، nested-pcr (با سه مجموعه آغازگر مختلف)، real-time pcr (با یک جفت آغازگر) و lamp (با دو مجموعه آغازگر مختلف) انجام و حساسیت، اختصاصیت و صحت برای هر روش بررسی شد. کلیه روش­ها، به­جز پی­سی­آر معمولی با آغازگر f1/r1 (90 درصد)، در مقادیر 100، 10 و 1 نانوگرم از دی­ان­اِی کل با حساسیت 100 درصد عامل بیماری را ردیابی کردند. روش پی­سی­آر معمولی (با هر کدام از چهار آغازگر) با مقدار 100 پیکوگرم dna، به­طور میانگین عامل بیماری را در حدود 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر 1 پیکوگرم تا 1/0 فمتوگرم نتوانست عامل بیماری را ردیابی نماید. روش lamp تا میزان 10 پیکوگرم از دی­ان­اِی کل را با حساسیت 20 تا 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر پایین­تر از این مقدار (1 پیکوگرم و کمتر از dna)، با هرکدام از دو مجموعه آغازگر قادر به ردیابی عامل بیماری نبود. حساسیت روش lamp شبیه یا در برخی مقادیر dna اندکی بیشتر از پی­سی­آر معمولی بوده ولی سریع­تر و ارزان­تر از آن است. روش nested-pcr (با هر سه جفت آغازگر برای دور دوم)، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد تا مقدار 1 پیکوگرم دی­ان­اِی کل ردیابی کرده و در کمترین مقدار دی­ان­اِی کل یعنی 1/0 فمتوگرم نیز با حساسیت حدود 30 درصد عامل بیماری را ردیابی نمود. روش real-time pcr تا 10 فمتوگرم dna، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد و در مقادیر 1 و 1/0 فمتوگرم dna، عامل بیماری را با حساسیت 90 درصد ردیابی نمود و بیشترین حساسیت را نشان داد؛ با وجود این، از عیوب این روش وقوع بیشتر نتایج مثبت کاذب نسبت به سایر روش ها می­باشد. براساس نتایج به دست آمده به دلیل حساسیت بالای روش­های real-time pcr و nested-pcr در ردیابی عامل بیماری hlb، استفاده از این روش­ها در ردیابی درختان آلوده به­ویژه در مناطقی که بیماری بتازگی وارد شده یا خطر آلودگی وجود دارد در کنار سایر روش­های ردیابی پیشنهاد می­شود. در بسیاری از شرایط استفاده از روش nested-pcr با توجه به کمتر بودن نتایج مثبت کاذب و ارزان­تر بودن نسبت به روش real-time pcr می­تواند انتخاب مناسب­تری برای ردیابی بیماریhlb باشد.