طراحی و ساخت کاست ژنی ctxb-gfp-stxbو بررسی بیان آن در e. coli سویه (bl۲۱ (de۳
چکیده
زمینه و هدف : پروتئینهای نوترکیب کایمریک ، به منظور افزایش بیان پروتئین های محلول، تسهیل در تخلیص آنها و تولید پلیپپتید چندمنظوره، ابداع شدهاند. هدف از این تحقیق، ساخت کاست ژنی ctxb -gfp-stxb و بررسی بیان آن به منظور بررسی میزان جذب و دفع آنتیژن الحاقی در مطالعات بعدی می باشد. مواد و روش ها : پس از تهیه پرایمرهای مورد نیاز برای ژنهای gfp به عنوان ژن گزارشگر، ctxb و stxb ، از تکنیک pcr برای تکثیر ژنها استفاده شد. ژنهای تکثیر شده، در وکتور pgem ، همسانهسازی و پس از تایید قطعات ژنی به ترتیب ctxb –gfp-stxb به یکدیگر ممزوج شدند. سپس، کاست ژنی ساخته شده، در وکتور بیانی pet28a(+) هم سانه سازی شد. باکتری e . coli سویه ( de3 (bl21 ، توسط وکتور نوترکیب، ترانسفورم شد و بیان پروتئین، تحت القای iptg و الکتروفورز sds-page ارزیابی شد. نتایج : ژن های تکثیر شده در وکتور pgem ، همسانهسازی شدند و کلونها به کمک سه روش pcr ، هضم آنزیمی و توالی یابی، تایید شدند. قطعات ژنی تایید شده به ترتیب ctxb -gfp-stxb به یکدیگر ممزوج شد. پس از زیرهمسانهسازی، وجود کاست ژنی ساخته شده به روش هضم آنزیمی تایید شد. برای این کاست ژنی، در e . coli سویه bl21(de3) ، بیانی مشاهده نشد. نتیجه گیری : تعداد زیاد کدون های نادر در ژن های stxb و ctxb ، باعث عدم بیان کاست ژنی در e .coli شد. بنابراین، برای دستیابی به بیان و بهینه سازی آن، یافتن میزبانی مناسب، ضروری است. با توجه به ساختار کاست ژنی و جایگاه آنزیم های محدودالاثر بر روی قطعه ساخته شده، ژن های مختلف را می توان جایگزین نموده و قطعات متنوع ژنی تولید نمود.