اثر تنش ناشی از سطوح آلودگی سرب در گیاه یونجه در شرایط تلقیح با جدایه های همزیست

مقدمه نیتروژن یکی از عناصرپرمصرف مورد نیاز یونجه است، پس از تشکیل گره بر روی ریشه، گیاه قادر به تامین بخش بزرگی از نیتروژن مورد نیاز خود را از هوا می باشد. میزان تثبیت نیتروژن در یونجه حدود 60 تا 500 کیلوگرم در هکتار در سال برآورد شده است. همزیستی بین ریزوبیوم و گیاهان لگوم با تبادل سیگنال های مولکولی بین باکتری ها و ریشه گیاه آغاز می شود. گونه های گیاهی، باکتری و شرایط خاک (فلزات سنگین، دما، آب، هوادهی، مواد مغذی، شوری، نیترات، pH و غیره) عواملی هستند که در همزیستی تاثیر می گذارمی باشند.. سرب یکی از عناصر سنگین آلاینده محیط‌زیست به‌ویژه خاک‌های کشاورزی می­باشد. در اراضی زیر کشت لگوم­ها آلودگی سرب می­تواند در همزیستی بین گیاهان میزبان و باکتری‌های ریزوبیوم، تثبیت زیستی نیتروژن و درنهایت رشد و عملکرد گیا­هان لگوم اثر سوء داشته باشد. استخراج سرب و روی و فعالیتهای مرتبط در استان زنجان باعث انتشار فلزات سنگین از جمله سرب در اطراف زمین های کشاورزی شده است، هدف از این مطالعه بود بررسی اثرات آلودگی سرب بر روی یونجه همزیستی ریزوبیوم بومی استان زنجان و تثبیت نیتروژن در گیاه یونجه بود.   مواد و روشها  در تحقیق حاضر ریشه یونجه حاوی گره از یونجه­­زارهای چندساله اطراف کارخانه‌های سرب و روی جمع­آوری و سپس باکتری‌های ریزوبیوم خالص­سازی شدند. مقاومت جدایه ­ها به آلودگی سرب در محیط کشت حاوی مقادیر مختلف کلرور سرب بررسی گردید. حداکثر غلظت سرب که در آن غلظت رشد جدایه‌ها قابل‌مشاهده بود، برای هر­یک از جدایه‌ها محاسبه و به‌عنوان شاخص MRL منظور گردید. بر اساس نتایج اندازه‌گیری مقاومت آن‌ها به سرب و نیز میزان کارایی آن‌ها، توان جدایه ­ها در تثبیت نیتروژن در خاک آلوده به سرب تعیین و پنج جدایه­ انتخاب و در آزمون گلخانه­ای کشت یونجه (رقم همدانی) مورداستفاده قرار گرفتند. تیمارها شامل تلقیح با جدایه­های سینوریزوبیوم در پنج سطح (N6، N12، N17، N41، N51 و شاهد) و غلظت سرب در پنج سطح (صفر، 5، 25، 50 و 100 میلی­گرم سرب در کیلوگرم از منبع کلرور سرب) بودند. آزمایش گلخانه­ای کشت یونجه به‌صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار با هدف ارزیابی اثر سرب بر گره­زایی و قدرت تثبیت نیتروژن باکتری‌های همزیست، انجام شد. بذور یونجه پس از ضدعفونی سطحی (محلول هیپوکلریت سدیم 1٪)، در انکوباتور جوانه زده شدند و سپس در گلدان کاشته شد. هر بذر با یک میلی لیتر از یک میلی لیتر سوسپانسیون  باکتریهای انتخاب شده (CFU 107 در میلی لیتر) تلقیح شد. 90 روز پس از کاشت، گیاهان برداشت شده و وزن خشک بخش هوایی تعیین شد. گره ریشه مورد بررسی قرار گرفت و به عنوان طبقه بندی شده توسط وینسنت توصیف شد. محتوای نیتروژن ساقه با استفاده از روش Kjeltec و جذب نیتروژن در بخش هوایی اندازه گیری شد.   نتایج و بحث همه باکتریها مورد بررسی توانستند در سیستم های ریشه یونجه گره ایجاد کنید. ارزیابی رشد جدا یه ها نسبت به شاهد در محیط حاوی غلظت های مختلف سرب نشان داد که، تعداد کمی از آنها در حداکثر غلظت سرب (500 میلی گرم سرب در لیتر) رشد کردند. شاخص MRL (حداکثر غلظت سرب که در آن جدا شده قابل مشاهده رشد داشته)، برای هر یک از جدایه ها تعیین ، سپس درصد نمونه های رشد یافته در غلظت های مختلف سرب، محاسبه شد. مقایسه میانگین اثرات متقابل جدا یه ها و سطوح سرب بر غلظت نیتروژن بخش هوایی نشان داد که با افزایش سطح سرب، در تمام جدایه ها، غلظت نیتروژن بخش هوایی کاهش یافت و این کاهش در اکثر موارد معنی داربود. بالاترین غلظت نیتروژن بخش هوایی (3.3) به شاهد (0 میلی گرم سرب در کیلوگرم و 70 میلی گرم) تعلق داشت و کمترین غلظت نیز (2.4٪) متعلق به تیمار100 میلی گرم سرب کیلوگرم و تلقیح با جدایه N6 بود. مقایسه میانگین ها نشان داد که با افزایش سطح سرب، وزن خشک بوته کاهش یافت، اما این کاهش در جدایه های مختلف متفاوت بود، بالاترین وزن خشک بخش هوایی (0.81 گرم در گلدان) به گیاهان تلقیح شده با سویه N51 در سطح 25 میلی گرم سرب کیلوگرم تعلق داشت، در حالی که کمترین آن (0.15 گرم در گلدان) به شاهد بدون تلقیح و 100 میلی گرم سرب کیلوگرم تعلق داشت.   نتیجه گیری  تحمل میکروارگانیسم همزیستی در برابر تنش های محیطی بیش از گیاهان میزبان آنها است. سمیت ناشی از غلظت بالای فلزات سنگین در خاک، مانع رشد و توسعه ریشه شده و مراحل اولیه همزیستی لگوم- ریزوبیوم و تبادل سیگنال های بیوشیمیایی بین آنها را مختل می کند. در مجموع 6.7 درصد از جدایه ها، بسیار مقاوم به سرب بوده و رشد آنها در محیط حاوی بالاترین غلظت سرب، هیچ تفاوتی با شاهد نداشت. در حالی که، برخی از جدایه ها قادر به رشد در محیط کشت حاوی بیش از 75 میلی گرم سرب نبودند. حدود 64 درصد از جدایه ها غلظت 25 تا 150 میلی گرم در لیتر سرب را تحمل نمودند. حدود 30 درصد از جدایه ها در محیط حاوی بیش از 300 میلی گرم سرب در لیتر، زنده ماندند. به طور کلی کاربرد سطوح مختلف سرب باعث کاهش نیتروژن گیاهان گردید و این کاهش در گیاهان تلقیح شده کمتر از شاهد بدون تلقیح بود. اگر چه تحمل یونجه در برابر تنشهای محیطی در مقایسه با باکتری های همزیستی کمتر است، با این حال، با تلقیح گیاهان میزبان توسط ریزوبیوم ها، می تواند تا حدودی آسیب ناشی از فلزات سنگین را کاهش دهد.