حذف ویروس ای انگور (grapevine virus a, gva) از گیاهان آلوده

ویروس ای مو (grapevine virus a, gva) یکی از ویروس های مهم بیماری زای انگور است که از سراسر جهان و مناطق مختلف کشت این محصول در ایران گزارش شده است. در گیاهانی مانند مو که به طریقه رویشی ازدیاد می یابند، آلودگی به راحتی از طریق پایه مادری به نسل های بعدی منتقل می شود. بنابراین ایجاد ژرم پلاسم عاری از ویروس به منظور تولید گیاهان مادری سالم از اهمیت زیادی برخوردار است. در این تحقیق روش های کرایوتراپی (cryotherapy) و الکتروتراپی برای حذف gva به کار گرفته شد و کارآیی آنها مقایسه گردید. روش کرایوتراپی طی دو آزمایش با 20 و 12 جوانه انجام شد. جوانه های انتهایی به اندازه یک میلی متر از گیاهانی که آلودگی آنها با استفاده از روش rt-pcr ثابت شده بود، جدا و در محیط کشت ¾ ms دارای 3% آلژینات سدیم، 2 مولار گلیسرول و 4/0 مولار سوکروز کشت گردید. این مخلوط همراه با جوانه های انتهایی، با استفاده از یک پیپت استریل به محلول cacl2 1/0 مولار شامل 2 مولار گلیسرول و 4/0 مولار سوکروز در دمای اتاق انتقال داده شدند. جوانه ها به مدت 30 دقیقه در محلول یاد شده نگهداری شدند تا به شکل بذرهایی به قطر حدود 4 میلی متر در آمدند. سپس بذرها به ترتیب به محیط کشت¾ ms غنی شده با سوکروز 25/0 ، 5/0 ، 75/0 ، 1 مولار منتقل و به مدت یک روز در هر مرحله نگهداری شدند. بذرها در تشتک های پتری روی کاغذ استریل درون شیکر انکوباتور، در دمای ?c 24 به مدت 12 ساعت آبگیری شدند. بعد از آبگیری بذرها به کرایوتیوب منتقل شدند و سپس به صورت مستقیم در نیتروژن مایع به مدت یک ساعت قرار داده شدند و سپس به سرعت به حمام آب گرم با دمای ?c40 منتقل شدند. پس از سه دقیقه بذرها مجدداً روی تشتک های پتری شامل محیط کشت ¾ ms جامد شامل 2 میکرومولار بنزیل آمینوپورین (ba) کشت شدند. تشتک های پتری در ?c 24 در تاریکی برای دو روز نگهداری شدند و سپس به دمای 2± 24 و 16 ساعت نور (با استفاده از لامپ فلوروسنت) منتقل شدند. بعد از 6 هفته که زنده ماندند و طول جوانه ها به حدود 3 میلی متر رسید، به محیط کشت ¾ ms جامد عاری از هورمون منتقل شدند. در این دو آزمایش میزان باززایی 4/1± 59% بود. ردیابی gva با استفاده از روش rt-pcr نشان داد که تمامی گیاهان باززایی شده از مراحل شاهد و آبگیری آلوده به gva بودند. در حالیکه 8/0±2/42% از گیاهان حاصل از مرحله انجماد عاری از ویروس بودند. به منظور مقایسه تاثیر روش کرایوتراپی و الکتروتراپی در حذفgva ، قلمه های آلوده به ویروس gva به اندازه سه سانتی متر در معرض شدت جریان 0، 10، 20 و 30 میلی آمپر به مدت 10 و 15 دقیقه قرار گرفتند، سپس ضدعفونی شده و در محیط کشت ms تغییر یافته قرار گرفتند و پس از دو ماه وجود ویروس در گیاهان رشد یافته با استفاده از روش rt-pcr بررسی شد. در تیمار الکتروتراپی به مدت 10 دقیقه جوانه ها به ترتیب100، 83%، 75% و 75% باززایی داشتند. در این تیمار ویروس از هیچ یک از گیاهان حذف نشد. در تیمار الکتروتراپی به مدت 15 دقیقه جوانه ها به ترتیب100، 75%، 5/62% و 5/62% باززایی شدند. یک و دو گیاهچه که به ترتیب تحت تاثیر شدت جریان 20 و 30 میلی آمپر به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند، عاری از ویروس شدند. نتایج این تحقیق نشان داد که روش کرایوتراپی نسبت به روش الکتروتراپی، روشی موثرتر و مناسبتر برای حذف gva از گیاهان آلوده می باشد.