معرفی و کلون سازی یک قطعه dna به عنوان یک کنترل داخلی (internal control) جهت تست rt-pcr رقابتی

نوویروس ها (nov) یکی از شایع ترین عوامل ایجاد کننده عفونت های غیرباکتریائی گاستروانتریت مزمن در جوامع انسانی می باشند. این ویروس ها اولین بار در سال1968 از اولین شیوع مربوط به مدرسه ای در منطقهnorwalk ایالت ohio آمریکا شناسائی گردیدند. نورویروس ها بسیار واگیردار بوده و به راحتی از طریق مدفوعی دهانی از فردی به فرد دیگر منتقل می شوند. بیماری، همراه با اسهال استفراغ بوده و 24-72 ادامه می یابد. این ویروس ها بدون پوشش همراه با کپسیدی به قطر 23-35 نانومتر و متعلق به خانواده کلسی ویریده می باشند. ویریون شامل یک قطعه rna مثبت تک رشته ای 7.6kb اندازه دارد با سه قالب خوانش، مسئول کد کردن انواع پروتئین های ساختمانی و غیرساختمانی می باشند. تنوع این ویروس ها سبب ایجاد مقاومت در جمعیت های انسانی می شود اما با این حال نورویروس های گروه ژنی gii.4 مسئول بروز تقریبا 80% از کل عفونت های گاستروانتریت در انسان می باشند. نورویروس های انسانی در 3 گروه ژنی gi، giiو giv قرار می گیرند. رایج ترین روش مورد استفاده برای تشخیص نورویروس ها روش میکروسکوپ الکترونی و واکنش rt-pcr می باشد. روش های مبتنی بر rt-pcr بسیار حساس و سریع بوده اما نیاز به طراحی و ساخت پرایمرهایی هستند که تمامی سویه های نورویروسی را تحت پوشش قرار دهد. روش واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی(real-time rt-pcr) و pcrرقابتی competitive rt-pcr)) روش های معتبرتر و قابل اعتمادتری نسبت به سایر روش ها می باشند. هدف از این پروژه طراحی و ساخت دو قطعه کنترل داخلی استاندارد و دو قطعه کنترل مثبت، بر مبنای ناحیه فوق حفاظت شده، واقع در بخش حدفاصل دو قالب خوانش orf1/orf2 نورویروس های گروه ژنی gi و gii ، که عمل اصلی ایجاد عفونت های گاستروانتریتی غیرباکتریایی انسانی می باشند، بود. استانداردهای داخلی برای هر گروه ژنی حاوی قطعاتی برای اتصال پرایمر بوده و از روی تفاوت در اندازه خود با قطعه الگو(هدف) قابل تفکیک می باشند. پس از طراحی و سنتز امپلیکون ها و قطعات کنترل مثبت به منظور تکثیر قطعات، واکنش pcr با پرایمرهای دژنره اعتبارسنجی شده و آنزیم taq پلیمراز انجام شد. محصولات pcr روی ژل آگارز 1.5% مشاهده و پس از استخراج و خالص سازی از ژل با درجه ذوب پائین، برای کلون شدن به داخل وکتور پلاسمیدی آماده گردید. هدف از این تحقیق کلون سازی تمامی قطعات به داخل وکتور پلاسمیدی ptz/57rt و ترانسفورماسیون پلاسمیدهای نوترکیب به داخل باکتری e.coli(gm2163) بود. همگی مراحل به صورت همگام با یکدیگر و به کمک کیت instaclone™ pcr cloning انجام شد. پس از کلونینگ و ترانسفورماسیون، باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب بر روی محیط انتخابی lb کشت شدند. پلاسمید های نوترکیب می بایستی حاوی وکتور به همراه قطعه insert مورد نظر باشند. کلون های باکتریایی نوترکیب توسط تست آبی-سفید مورد غربالگری قرار گرفتند. هر dna پلاسمیدی به روش استخراج پلاسمید در حجم کم استخراج و توسط آنالیزهای colony pcr و هضم آنزیمی مورد تائید قرار گرفتند. پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده توسط آنزیم های مناسب محدودالاثر مورد هضم (برش) قرار گرفتند. پس از مشاهده باندهای مورد نظر حضور قطعه dna insert و موفقیت انجام کلونینگ مورد تائید قرار گرفت. در نهایت کلون های باکتریائی نوترکیب به صورت متواالی پاساژ شده و پس از استخراج پلاسمید آن ها به منظور استفاده در یک تست pcr رقابتی در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهدای شدند. استفاده از معرف های تهیه شده جهت تولید کیت های تشخیصی عفونت های نوروویروسی و آلودگی های نوروویروسی منابع آب و غذا با استفاده از تست های rt-pcr ،real-time rt-pcr و هم چنین جهت کیت های سنجش کمی این ویروس ها به روش real-time rt-pcr وcompetitive rt-pcr که از دسترس ترین نتایج این پژوهش می باشد.