بررسی انتقال ژن cry1ab به ژنوم کلزا با استفاده از آگروباکتریوم

چکیده کلزا ((brassica napus l. یکی از گیاهان دانه روغنی محسوب می شود که پس از سویا و خرما، سومین مقام تولید روغن در جهان را به خود اختصاص داده است. این گیاه توسط برخی از آفات راسته بال پولک داران به طور جدی مورد حمله قرار گرفته و موجب افت شدید کمیت و کیفیت محصول آن می شود. با انتقال ژن cry1ab (کد کننده پروتئین سمی برای حشرات راسته بال پولک داران) به گیاه کلزا، می توان مقاومت آن را در برابر حشرات بهبود داده و متعاقبا باعث کاهش استفاده از آفت کش های شیمیایی و خطرات زیست محیطی مرتبط با آنها شد. کشت بافت یکی از تکنیک های مورد نیاز برای انجام انتقال ژن می باشد. بنابراین در این تحقیق راهکارهای مختلف برای افزایش کارایی کشت بافت و انتقال ژن مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحقیق بیشترین میزان باززایی از ریزنمونه هیپوکوتیل 10 روزه یعنی 55% و 65/46% به ترتیب در رقم هایولا 401 در محیط پیش تیمار حاوی naa (mg/l 1/0) و رقم rgs در محیط پیش تیمار حاوی (mg/l 1/0 =naa + mg/l5/0= kin) و بیشترین میزان باززایی (64%) از ریزنمونه کوتیلدون 5 روزه در رقم اکاپی در محیط پیش تیمار حاوی bap (mg/l 1/0) بدست آمد. بنابراین انتقال ژن cry1ab تحت کنترل راه انداز camv 35s در دو ریزنمونه هیپوکوتیل و کوتیلدون از دو رقم اکاپی و rgs با توجه به خالص بودن این ارقام و با در نظر داشتن فاکتورهای موثر در تراریزش بواسطه agrobacterium tumefaciens سویه lba4404 مورد بررسی قرار گرفت. غربالگری توسط آنتی بیوتیک کانامایسین در 2 مرحله انجام گرفت. در مرحله اول، کانامایسین (mg/l 50) در ترکیب محیط کشت بکار برده شد و در مرحله دوم غربالگری، دیسک های برگی از گیاهان تراریخته احتمالی تهیه و در تیوب های حاوی محلول (mg/l 1) bap و کانامایسین (mg/l 50) در اتاقک کشت به مدت یک هفته نگهداری شدند. گیاهانی که برگ های آنها سبز باقی مانده بود، انتخاب شدند و در نهایت حضور ژن cry1ab توسط آنالیز pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن cry1ab در گیاهان مقاوم به کانامایسین تایید شد. کاربرد دو مرحله ای غربالگری در تراریزش باعث کاهش زمان و تعداد آنالیز مولکولی pcr و در نهایت باعث کاهش هزینه ها شد. نتایج نشان داد که تلقیح ریزنمونه های کوتیلدون و هیپوکوتیل، تحت شرایط مدت زمان هم کشتی 48 ساعته، 8/0 =od600 و استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین به فاصله یک هفته از محیط هم کشتی باعث افزایش کارایی تراریزش می شوند. بیشترین کارایی تراریزش در این تحقیق 4% بدست آمد. پروتوکل بدست آمده در این تحقیق از تکرار پذیری و کارایی بالایی برخوردار بوده و می تواند در تراریزش گیاهان کلزا بدون وابستگی به ژنوتیپ استفاده گردد.