بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب rtf از کشت انبوه پیکیا پاستوریس ترانسفورمه جهت ساخت و ارزیابی معرف pt

tissue factor ، فاکتور iii انعقادی یا cd142 یک گلیکوپروتئین غشائی است که با فاکتورvii انعقادی متصل شده و باعث آغاز آبشار انعقادی می گردد. استفاده از این فاکتور به عنوان معرف در تست انعقادی خون pt (prothrombin time) یکی از رایج ترین کاربردهای آن است. آزمایش pt یک تست غربالگری برای تشخیص نقص در فاکتورهای انعقادی و همچنین بررسی چگونگی درمان با داروهای ضدانعقاد خون نظیر وارفارین به شمار می رود. در این تحقیق برای تولید پروتئین نوترکیب rtf فعال جهت استفاده در تست pt، از سازه ppicz-tf که قبلا" در همین گروه توسط هنرمند و همکاران تولید گردیده بود، استفاده شد. در این سازه ژن rtf در فرودست پروموتر الکل اکسیدازi و فرادست his-tag کلون شده است. سازه ppicz-tf خطی شده با روش ترانسفورماسیون الکتریکی به میزبان پیکیا پاستوریس منتقل شد، در سلول های ترانسفورم شده جایگاه درج شدن سازه ppicz-tf بر روی کروموزوم پیکیا پاستوریس مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت و مشخص گردید که سازه مذکور بر روی کروموزوم 4 در فرودست ژن الکل اکسیدازi درج گردیده است. بررسی های فنوتیپی انجام شد و mut+ بودن سلول های ترانسفورم شده را تأیید کرد. جهت بررسی بیان پروتئین نوترکیب rtf، سلول های mut+ در محیط های مناسب کشت داده شدند. حضور باند پروتئینی 43 کیلودالتونی مربوط به پروتئین rtf در عصاره سلولی بدست آمده از این سلول ها توسط sds-page و western blot مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. پروتئین rtf توسط ستون افینیتی نیکل از عصاره سلولی تخلیص شد و مجددا" توسط sds-page و western blot مورد بررسی قرار گرفت و نتایج بدست آمده نتایج قبلی را تأیید کرد. برای بررسی فعالیت پروتئین rtf به میزان بیشتری از این پروتئین نیاز بود. برای این منظور سلول های mut+ در حجم بیشتری کشت داده شدند و پروتئین rtf از عصاره سلولی تخلیص گردید. برای آماده سازی پروتئین rtf جهت انجام آزمایش pt، پروتئین تخلیص شده با لیپوزوم حاصل از دو فسفولیپید فسفاتیدیل کولین و فسفاتیدیل سرین مخلوط شد و فعالیت انعقادی آن روی 6 پلاسمای طبیعی و بیمار با انجام تست pt مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تست انعقادی پروتئین rtf اختلاف کمی با نتایج کنترل داشت که نشانگر فعالیت انعقادی پروتئین rtf می باشد.