شناسایی قارچ های اکتومیکوریز درختان بلوط در برخی جنگل های ایران و بررسی پروفایل متابولیکی و ترنسکریپتومیکی ریشه های همزیست quercus castaneifolia

همزیستی اکتومیکوریزایی، نقش کلیدی را در استقرار و عملکرد درختان در اکوسیستم های جنگلی ایفا می کند. در بخش اول این تحقیق شناسایی برخی قارچ های اکتومیکوریز همراه با درختان بلوط (quercus) -که مهمترین و فراوانترین گونه های درختی موجود در جنگل های کشور را تشکیل می دهند- در شش رویشگاه از جنگل های شمال کشور صورت گرفت. در بازدید از این جنگل ها، نوک ریشه های اکتومیکوریزایی درختان بلوط جمع آوری شد. برای شناسایی مولکولی قارچ ها ناحیه its1-5.8s-its2 با آغازگرهای گونه های قارچی، تکثیر و تعیین توالی شد. سپس تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی آنها با توالی های موجود در پایگاه داده ها با روش بیزی (bayesian method) صورت گرفت. در مجموع 207 سیستم ریشه ای از رویشگاه های مورد مطالعه جمع آوری و 49 تاکسون از قارچ های اکتومیکوریز در میان آنها شناسایی شد که متعلق به 13 جنس، شامل amanita، boletus،cortinarius، hebeloma، hydnum، hygrophorus، inocybe، laccaria، lactarius، lycoperdon، russula، scleroderma و tricholoma بودند. گونه هایی از lactarius، russula و inocybe غالب ترین و متنوع ترین گروه های یافت شده در این تحقیق بودند که این گروه ها از مشخص ترین قارچ های گزارش شده از ریشه بلوط در اکوسیستم های معتدله مختلف می باشند. در بخش دوم این تحقیق برای شناسایی سازوکار های مولکولی احتمالی دخیل در سیگنال‎دهی، برقراری ارتباط و تعاملات در همزیستی‎ اکتومیکوریزایی و به دست آوردن تصویری شفاف‎تر از عملکرد این همزیستی، تلفیقی از راهکارهای بیوشیمیایی و مولکولی بکار گرفته شد. بدین منظور پس از برقرار نمودن همزیستی در شرایط درون شیشه ای میان قارچ اکتومیکوریز hebeloma sinapizans و گیاهچه های کشت بافتی q. castaneifolia، ارزیابی خصوصیات مرفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاهچه های مایه زنی شده در مقایسه با گیاچه های شاهد و سپس بررسی های بیوشیمیایی و ژنتیکی بمنظور شناسایی ژن ها و متابولیت های دخیل در تشکیل و عملکرد این همزیستی صورت گرفت. در این تحقیق پروتکلی برای ریزازدیادی آزمایشگاهی q. castaneifolia با استفاده از بخش های گره دار و جوانه دار سرشاخه های این گیاه برای نخستین بار معرفی شد. همچنین برای اولین بار در کشور، همزیستی اکتومیکوریزایی در شرایط درون شیشه ای روی گیاهچه های درختی برقرار شد. براساس این نتایج، ایجاد همزیستی اکتومیکوریزایی روی گیاهچه های q. castaneifolia موجب افزایش معنی دار بیومس ساقه، بیومس، سطح و کلروفیل برگ و نیز بهبود محتوای آبی گیاهچه ها شد. بررسی های بیوشیمیایی روی نیمرخ آمینواسیدها (توسط hplc)، قندها (توسط hplc) و اسیدهای چرب (توسط gc-fid) در ریشه های درگیر در همزیستی اکتومیکوریزایی صورت گرفت. مطالعه محتوای اسیدهای آمینه نشان دهنده تجمع آرژینین، سیترولین و آسپارتیک اسید در ریشه های مستقل q. castaneifolia در مقایسه با ریشه های همزیست شده بود. در سیستم ریشه ای میکوریزایی سطح این آمینواسیدها کاهش و به موازات آن غلظت اسیدهای آمینه گلوتامیک اسید، آسپاراژین، گلوتامین و آلانین افزایش یافت. ارتباط این تغییرات و عملکرد همزیستی اکتومیکوریزایی تفسیر شده است. در مجموع غلظت اغلب اسیدهای آمینه در سیستم ریشه ای میکوریزایی افزایش نشان داد. بررسی محتوای قندها نشان دهنده حضور مقادیر بالایی از کربوهیدرات ها در ریشه های اکتومیکوریزایی q. castaneifolia بود که با افزایش ارسال کربن به سیستم ریشه ای میکوریزایی، در پاسخ به درخواست بالای کربن از جانب شریک قارچی همزیستی در ریشه های کلونیزه شده، در تطابق می باشد. اگرچه در ترکیب اسید چرب های غالب موجود در ریشه های اکتومیکوریزایی در مقایسه با ریشه های شاهد تغییری ایجاد نشد و اسید چرب های غالب در هر دو نوع ریشه شامل پالمیتیک اسید و لینولئیک اسید بود، اما تلقیح با قارچ موجب تغییراتی در محتوای اسیدچرب های مختلف ریشه q. castaneifolia شد که دلایل این تغییرات در اثر همزیستی اکتومیکوریزایی تفسیر شده است. بمنظور بررسی نحوه ی تغییر در بیان ژن های گیاهچه های q. castaneifolia طی برقراری همزیستی اکتومیکوریزایی و شناسایی ژن های اختصاصی این همزیستی، از تجزیه cdna-aflp استفاده شد. در مجموع با استفاده از 9 ترکیب آغازگری 153 قطعه مشتق از رونوشت با بیان افزایش یافته در ریشه اکتومیکوریزایی نسبت به ریشه شاهد مشاهده شد که از میان آنها 116 قطعه با موفقیت تعیین تـوالی گـردید. هجـده قطعه شباهتی با توالی های نوکلئوتیدی ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ncbi نشان نداده و بعنوان ژن های جدید بافت همزیست q. castaneifolia/h. sinapizans معرفی می شوند. توالی 63 قطعه دارای همولوژی بالا (>1e-5) با توالی ژن های کد کننده پروتئین های شناخته شده از گروه های مختلفی که در فرآیندهای تغییر مدل دیواره سلـولی، تردد وزیکلی، فعـال سازی تولـید و ترشح متابـولیت های ثانویه، تغـییر در بیوسنتز فلاوونوئیدها، فعال سازی مسیرهای سیگنال دهی و شناسایی افکتورها، تنظیم بیان ژن ها و ترجمه پروتئین ها و نیز ژن هایی که در فرآیندهای همزیستی نظیر تبادلات غذایی، تشکیل ریشه های جانبی و زوال ریشه های مویین نقش دارند، نشان دادند. این نخستین مطالعه ای است که ژن های القاء شونده در اثر همزیستی اکتومیکوریزایی در ریشه های بلوط q. castaneifolia را گزارش می نماید. شناسـایی این ژن ها در ریشـه های همزیست شده میزبان، نتایجی سودمند در جهت روشن سـاختن مکانیسم-های مولکولی کنترل کننده همزیستی اکتومیکوریزایی محسوب می گردد.