چکیده: امروزه با توجه به رشد تقاضا و اهمیت تغذیه ای که اسیدهای چرب دارند، بحث ارتقاء کیفیت دانه های روغنی از منظر سلامت، امنیت غذایی و نیز فرآوری صنعتی دارای اهمیت ویژه ای است. در سال های اخیر در کشورهای در حال توسعه و بویژه اروپا، پیشرفت های ارزنده ای در امر تغییر محتوای ژنتیکی دانه های روغنی در راستای تولید اسیدهای چرب صنعتی و تغذیه ای مهم بدست آمده است و گیاهان ترانس ژن گوناگونی با قابلیت های جدید معرفی گردیده اند. بدون شک دستکاری کارآمد محتوای چربی های گیاهی و محتویات آنها نیازمند دانستن جزییات دقیق بیوشیمیایی و مکانیسم های تنظیم بیوسنتز چربی هاست. در ده سال گذشته مطالعات بیوشیمیایی و ژنتیکی درک ما را از سنتز چربی ها و شناسایی آنزیم هایی که ترکیب روغن های ذخیره ای را تعیین می کنند افزایش داده اند به نحوی که امروزه با استفاده از تکنیک های بیولوژی مولکولی و ژنتیک بسیاری از ژنهای کد کننده این آنزیم ها، شناسایی، همسانه سازی و دستورزی گردیده اند. از بین اسیدهای چرب گامالینولنیک(gla) و استئارودونیک اسید(sda)، از لحاظ دارویی_ تغذیه ای و صنعتی بسیار ارزشمند بوده و در خانواده های گیاهی کمیاب هستند. glaو sda هر دو توسط فعالیت آنزیم دلتا 6 دسچوراز به ترتیب روی سوبستراهای اسید لینولئیک و آلفا لینولنیک سنتز می شوند. این آنزیم یک پیوند دوگانه را در موقعیت کربن 6 به این سوبستراها اضافه می کند و بدین طریق عمل غیر اشباع سازی (دسچوریشن) را انجام می دهد. عملی که آنزیم دلتا 6 دسچوراز انجام می دهد یک مسیر دسچوریشن اضافی است که تنها در تعداد محدودی از گیاهان عالی وجود دارد. در تحقیق حاضر cdna کد کننده آنزیم دلتا 6 دسچوراز، از گل گاو زبان ایرانی (echium amoenum) شناسایی، جداسازی و همسانه سازی گردید. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه ncbi، پرایمرهای مناسب جهت شناسایی ژن در سطح dna ژنومیک طراحی شد و در نخستین گام قطعه ای با طول bp 800 که همولوژی بسیار بالایی با ژن های گزارش شده قبلی داشت، از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز بدست آمد. سپس پرایمرهای ویژه جهت ایزولاسیون cdna ژن، که سایت های برشی آنزیم های sac i وxba i در ناحیه 5 پریم آنها تعبیه شده بود طراحی گردیدند. در گام بعدی total rna از اندام های مختلف گل گاو زبان (ریشه، ساقه، برگ، بذر، گل) استخراج شد. سپس با استفاده از rna استخراجی، و با استفاده از واکنش نسخه برداری معکوس اقدام به ساخت cdna کل گردید. cdna ساخته شده بعنوان الگو در واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از پرایم های ویژه ایزولاسیون استفاده شد، که منجر به تکثیر قطعهbp 1347 مربوط به cdna ژن دلتا 6 دسچوراز گردید. قطعه مذکور از روی ژل آگاروز خالص سازی گردید و در وکتور کلونینگ pbluscripts داخل باکتری اِ.کلای (dh5?) همسانه سازی شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب حاوی اینزرت تعیین توالی گردید و پس از انجام آنالیزهای بیوانفورماتیکی مختلف، توالی کد کننده ژن دلتا 6دسچوراز گونه (e.amoenum) در پایگاه ncbi با شماره دسترسی مشخص به ثبت رسید. واژه های کلیدی: آنزیم دلتا 6 دسچوراز، گامالینولنیک اسید، استئارودونیک اسید، واکنش نسخه برداری معکوس، همسانه سازی

کشت ریشه های موئین بعلت رشد سریع، زمان دو برابر شدن کوتاه، سهولت نگهداری و توانایی سنتز گستره ای از ترکیبات شیمیایی و همچنین استفاده از آن به عنوان یک سیستم مدل ارزشمند برای ارزیابی، توسعه و کاربرد اصول مهندسی ژنتیک در گیاهان مورد توجه قرار گرفته است.گیاه دارویی کاسنی(cichorium intybus) و گل گاوزبان (echium amoenum) از جمله گیاهان با ارزش دارویی هستند که در طب سنتی و مدرن مورد استفاده قرار می گیرند.کاسنی حاوی متابولیت های ثانویه شناخته شده ی فراوان و مهمی از جمله اینولین، اسکولین و کومارین و گل گاوزبان نیز حاوی ترکیبات و متابولیت های ارزشمندی چون، آلکالوئیدهای پیرولیزیدینی، شیکونین، رزمارنیک اسید، اسیدهای چرب غیر اشباع، کوئینون و نفتاکوئینون می باشد. در این مطالعه ابتدا اثر نوع محیط کشت ( (ls, ms, b5 و قابلیت سویه های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز (15834, a13,11325,a4)، بمنظور القاء ریشه های تراریخت در گیاه کاسنی و گل گاو زبان بررسی گردید. سپس ژن gus با موفقیت در ریشه های تراریخت گیاه کاسنی بیان شد و تیمارهای مختلف هورمونی بمنظور بهینه سازی شرایط باززایی گیاه کامل از ریشه های موئین مورد آزمون قرار گرفت. بر این اساس محیط کشت ms و سویه a13 با درصد فراوانی 15/63%، در القاء ریشه زایی روی ریزنمونه های کوتیلدونی گیاه کاسنی انتخاب گردید. بیشترین میزان وزن خشک ریشه موئین برای گیاه کاسنی در محیط ms و تراریختی با سویه a13 و کمترین میزان وزن خشک در محیط b5 و در اثر تراریختی با سویه a4 مشاهده شد. همچنین فنوتیپ رشد ریشه های موئین به صورت سه گروه کلون های تند، کند و متوسط رشد توصیف شد. از این لحاظ بیشترین وزن خشک مربوط به کلون تند رشد c1 از سویه a4 با 250 میلی گرم ماده خشک و کمترین آن متعلق به کلون کند رشد c1 از سویه 15834 با 6/4 میلی گرم ماده خشک تعیین گردید. آزمون هیستوشیمیایی بیان پس از ایجاد ریشه های تراریخت توسط سویهa13 حامل پلاسمید pcambia1304حاوی ژن gus در گیاه کاسنی، کلون های ریشه ای با درجات متفاوتی از بیان موقت و پایدار را آشکار ساخت. در بررسی تیمارهای باززایی برای کلون های ریشه ای که به تست بیان ژن gus پاسخ مثبت دادند، مشخص گردید که اگرچه تمامی تیمار های مورد آزمون منجر به تولید کالوس از ریشه ها گردیدند ولی در نهایت در هیچ یک از تیمارها شاخه زایی و باززایی کامل القاء نشد. نتایج نشان می دهد با افزایش غلظت هورمون های سیتوکینینی رشد ریشه های مویین در محیط کشت کاهش یافته و کالوس ها سبز و توده ای می شوند. در این مطالعه گیاه گل گاو زبان برخلاف کاسنی بعلت شدت بالای آلودگی های میکروبی و عدم پاسخ به سویه های مورد بررسی آگروباکتریوم ریزوژنز و روش های معمول انتقال ژن بواسطه آگروباکتریوم بعنوان گونه مقاوم تر به تهاجم پاتوژنی باکتری ریزوژنز معرفی گردید.

روش های متعددی برای آشکارسازی جهش های تک نوکلئوتیدی ابداع گردیده است. اندونوکلئاز cel ii یک گلیکوپروتئین خارج سلولی است که از گیاه کرفس متعلق به خانواده چتریان جداسازی شده است. این آنزیم از قابلیت تکنیکی بسیار مطلوب در برش dna هترودوپلکس برخوردار است که آن را بسیار ارزشمند می نماید. جنبه های کاربردی آنزیم cel ii در مطالعات جهش های نقطه ای، تقاضای جهانی قابل توجهی را برای آن بوجود آورده و با توجه به اهمیت این آنزیم، این تحقیق با هدف دست یابی به اطلاعات توالی رمز کننده mrna این آنزیم و همسانه سازی این توالی از گیاه کرفس انجام پذیرفت. در واقع انجام این تحقیق به عنوان گام اول در راستای تولید cel ii نوترکیب در ایران، امری مهم بود. برای کلون کردن ژن cel ii پس از استخراج rna و سنتز cdna، قطعه ژن cel ii تکثیر شد. پس از تهیه پلاسمید ptz57r/t، واکنش لیگاسیون انجام شد و پس از تهیه سلول های مستعد پذیرش پلاسمید، محصول واکنش لیگاسیون جهت آزمایش کلنینگ به کار برده شد. از آن جایی که پلاسمید ptz57r/t دارای ژن مقاومت به آمپی سیلین می باشد، پس از انجام واکنش کلنینگ باکتری های e.coli سویه dh5? در محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین کشت داده شدند. از رسوب های حاوی ماده x-gal و iptg جهت تشخیص کلنی هایی که cdna مربوط به ژن cel ii وارد شده به پلاسمید ptz57r/t را دریافت نمودند استفاده شد. جهت تایید اولیه صحت همسانه سازی، پس از کشت خطی کلنی های سفید در محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، واکنش colony pcr جهت تایید وجود قطعه cdna درون پلاسمید ptz57r/t انجام گرفت. سپس جهت بررسی بیشتر و تایید نهایی همسانه سازی، پلاسمید استخراج شد و برای تعیین توالی بصورت رفت و برگشت با پرایمرهای عمومی ارسال شد. هر دو توالی تعیین شده از دو سر قطعه کلون شده با توالی گزارش شده همردیف گردید و مشخص شد که هر دو توالی خوانده شده مربوط به ژن cel ii می باشد و با آن همولوژی کامل دارد.

گلرنگ (carthamus tinctorius l.) متعلق به خانواده مرکبان (asteraceae)، علفی، یک ساله، دیپلوئید، خود سازگار، با ظاهری خارمانند و جزو گیاهان پرشاخه است. به دلیل تولید متابولیت های ثانویه فراوان و مقاومت بالای گلرنگ در برابر استرس های محیطی، این گیاه می تواند به عنوان یک گیاه مدل جهت مطالعه مکانیسم های دفاعی مختلف مورد استفاده قرار گیرد. مسیر فنیل پروپانوئید یکی از مسیرهای مهم دفاعی گیاهی در برابر انواع تنش های زیستی و غیرزیستی محسوب می شود. در این تحقیق بیان دو ژن مهم این مسیر یعنی pal و chs پس از جداسازی این ژن در گیاه گلرنگ مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور گیاهان 14 روزه رقم مقاوم 191-22 گلرنگ تحت تیمار دو غلظت sa (یک دهم و یک میلی مولار) و دو تنش زخم مکانیکی برگ و شوری قرار گرفتند. پس از استخراج rna کل از نمونه ها و سپس سنتز cdna، با استفاده از روش rt-pcr نیمه کمی بررسی بیان این دو ژن صورت گرفت. نتایج حاصل از آنالیز مولکولی نشان داد که بیان این ژن ها در ساعات اولیه (3 و 6) پس از تیمار بیشترین افزایش را نشان می دهد. این نتایج حاکی از افزایش فعالیت ژن های دفاعی و در نتیجه فعال شدن مسیرهای مقاومت فنیل پروپانوئید و فلاونوئید، در زمان های اولیه پس از اعمال تیمار دارد.

اعضای خانواده اندونوکلئاز si، نوکلئازهای اختصاصی تک رشته ای با قابلیت هضم dna هترودوپلکس می باشند. یکی از اعضای این خانواده با نام cel ii به ویژه گیاه کرفس دیده می شود که قادر است dna هترودوپلکس را در قطعات dna با کارایی مطلوب در شرایط آزمایشگاهی برش دهد و موارد کاربردی متعددی در ژنتیک، بیوتکنولوژی و تشخیص مولکولی ژن های معیوب دارد. با وجود مطالعات متعدد در خصوص کاربردهای بیوتکنولوژیک این گروه از آنزیم ها، اهمیت عمکردی آنها در in vivoو نقش آنها در رشد و تمایز مورد مطالعه دقیق قرار نگرفته است. لذا نخستین گام در جهت تبیین نقش کلیدی این آنزیم ها مطالعه الگوی بیان ژن آن ها در بافت های مختلف از یک طرف و همچنین مطالعه روند تکاملی تغییرات ساختاری ژن های مربوطه از طرف دیگر است. لذا در مطالعه حاضر به منظور تبیین نقش بیولوژیک آنزیم cel ii، 1) نسبت به همسانه سازی ژن cel ii از گیاه کرفس اقدام کرده و ماهیت مولکولی آن از جهت نسبت حفظ شدگیساختاری در طی تکامل بررسی شد. 2) مطالعات بیوانفورماتیک به منظور روشن شدن محل فعالیت درون سلولی انجام گرفت. 3) الگوی بیان ژن به منظور تعیین جایگاه فعالیت آن مورد آزمایش قرار گرفت. بدین منظور بیان ژن cel ii در بافت های مختلف گیاه کرفس، با استفاده از تکنیک rt-pcr به طور نیمه کمی مورد بررسی قرار گرفت. پس از استخراج dna ژنومی و تکتیر قطعه ژن its، ژن مورد نظر برای تعیین توالی ارسال شد همچنین پس از استخراج rna، سنتز cdna و تکثیر قطعه cel iiو تهیه پلاسمید ptz57r/t، واکنش اتصال و انتقال پلاسمید به سلول های مستعد پذیرش پلاسمید انجام شد. به منظور تایید صحت همسانه سازی، سازه ژنتیکی حاصل برای توالی یابی ارسال شد. همچنین جهت بررسی بیان آنزیم cel ii در بافت های مختلف گیاه کرفس از روش rt-pcr نیمه کمی استفاده شد و به منظور متوازن کردن میزان rna وارد شده به واکنش ها، از آغازگرهای عمومی یوبی کوئیتین استفاده گردید. با بررسی نتایج به دست آمده از تعیین توالی ژن its و همردیفی آن با توالی ثبت شده در ncbi (ژن بانک fj986043.1) تفاوت حدود 9 درصدی بین آن ها مشاهده شد. نکته قابل ملاحظه این که بررسی نتایج تعیین توالی ژن cel iiو همردیفی آن با توالی گزارش شده، نشان-دهنده همردیفی 100% آن ها بود. مطالعه الگوی بیان ژن cel ii در بافت های ساقه، برگ، دمبرگ و گل که به منظور تعیین محل دقیق فعالیت بیان ژن مربوطه انجام گرفت نشان داد که اگرچه این ژن در تمام بافت های مورد مطالعه بیان می شود، اما میزان بیان آن در برگ حداکثر و در ساقه حداقل می باشد.

تکنیک هضم آنزیمی dna هترودوپلکس، یکی از متداول ترین تکنیک های مورد استفاده در شناسایی جهش های نقطه ای در قطعات ژنومی است. در حال حاضر، آنزیم های cel i و cel ii استخراج شده از گیاه کرفس (apium graveolens l.)، از کاربرد بسیار گسترده ای در این زمینه برخوردارند. این آنزیم ها بصورت عصاره خام آنزیمی و کیت های تجاری در دسترس محققان قرار دارند. در سال های اخیر تحقیقات متعددی در زمینه شناسایی و معرفی آنزیم های اندونوکلئاز جدید با قابلیت هضم اختصاصی نواحی هترودوپلکس در مولکول های dna انجام شده است. شناسایی و توصیف هر آنزیم جدید در این حوزه، علاوه بر ارائه خصوصیات عملکردی و کاربردی بیشتر، اطلاعات جدیدی را در رابطه با مکانیزم عمل و تکامل ژنتیکی این خانواده آنزیمی در اختیار محققان قرار میدهد. در این تحقیق، با توجه به گزارش اخیر مبنی بر فعالیت نوکلئازی قوی تر عصاره آنزیمی گیاه جعفری (petroselinum crispum l.) در مقایسه با گیاه کرفس، توالی های ژنی رمزکننده آنزیم های اندونوکلئاز اختصاصی تک رشته از گیاه جعفری جداسازی گردیده و به نام های pars i و pars ii نامگذاری شدند. همچنین، جهت مقایسه ساختاری و بررسی کمیت و کیفیت فعالیت آنزیمی نوکلئازهای هدف از گیاه جعفری، توالیهای کد کننده آنزیم های cel i و cel ii نیز به عنوان نمونه های کنترل مثبت از گیاه کرفس جداسازی گردیدند. مطالعه خصوصیات فیزیکوشیمیایی، ساختار مولکولی و قرابت ژنتیکی نشان داد که دو آنزیم pars i و pars ii به خانواده نوکلئازهای s1/p1 تعلق داشته و شباهت زیادی به نوکلئازهای cel i و cel ii نشان می دهند. با توجه به مشابهت زیاد توالی ژنی parsii به نوکلئاز اصلی کیتهای تشخیص جهش surveyor® (آنزیم cel ii)، این توالی ژنی به ناقل بیان پروکاریوتی pqe60 به منظور تولید فرم نوترکیب آن در باکتری e. coli منتقل گردید. سازه بیانی ساخته شده، جهت تولید، خالص سازی و بررسی فعالیت آنزیمی پروتئین نوترکیب مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

تکنیک هضم آنزیمی dna هترودوپلکس، یکی از متداولترین تکنیک های مورد استفاده در شناسایی جهش های نقطه ای قطعات ژنومی است. در سال های اخیر تحقیقات متعددی در زمینه شناسایی و معرفی آنزیم های اندونوکلئاز جدید با قابلیت هضم اختصاصی با نواحی هترودوپلکس در ملکول های dna انجام شده است، در حال حاضر آنزیم های cel i و cel ii (آنزیم اصلی کیت های تشخیص جهش ترانس ژنومیک) از گیاه کرفس (apium graveolens l.) در این زمینه کاربرد بسیار گسترده ای دارند. در این تحقیق با توجه به فعالیت نوکلئازی قوی تر عصاره گیاه جعفری (petroselinum cripsum l.) در مقایسه با گیاه کرفس، و همچنین همولوژی بالا بین pars ii و cel ii، دومن مرکزی pars ii (cpars ii) در سیستم بیان باکتریایی (m15) ساخته شد. پروتئین نوترکیب cpars ii از طریق تکنیک sds-page آنالیز گردید نتایج حاصل از الکتروفورز روش sds-page یک باند در موقعیت 30 کیلودالتون نشان داد که منطبق با اندازه مورد نظر بود. از آنجائیکه باکتری e. coli قادر به انجام تغییرات پس ار ترجمه یوکاریوتی مانند گلیکوزیلاسیون نمی باشد و این امر برای فولدینگ تولید پروتئین فعال محدودیت ایجاد می کند. بنابراین پروتئین cpars ii می تواند در این سیستم فعال باشد. و فعالیت آنزیمی پروتئینی نوترکیبی cpars ii بر روی سوبسترای dna هترودوپلکس مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

چکیده ویروس پیچیدگی برگ شلغم ( turnip curly top virus, tctv) یک جمینی ویروسی جدید با ویژگی های منحصر به فرد است که در سال 1389 از ایران (فارس) گزارش شده است. مطالعه ویژگی های بیولوژیکی این ویروس، مستلزم برقراری یک روش ردیابی ویروس در طبیعت است. بدلیل کارائی بهتر روش های سرولوژیکی در شناسایی ویروس های گیاهی، در تحقیق حاضر اقدام به فراهم سازی بستری جهت تولید آنتی بادی و به تبع آن، ردیابی این ویروس در طبیعت گردید. بدین منظور، بجای تهیه ویروس خالص، تولید پروتئین پوششی نوترکیب ویروس در سیستم پروکاریوتی مد نظر قرار گرفت. ژن مزبور جهت بیان، پس از همسانه سازی در ناقل pqe60، به باکتری e. coli جدایه m15 منتقل شد. پس از القای بیان، پروتئین تولید شده با استفاده از تکنیک sds-pageمورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده، پروتئین پوششی ویروس پس از رنگ آمیزی، در ژل پلی اکریل آمید 5/12% مشاهده گردید. وزن مولکولی پروتئین پوششی بر اساس نرم افزار آنلاین expasy7/33 کیلو دالتون محاسبه گردید که با وزن مولکولی نوار مشاهده شده در آزمون sds-page نیز مطابقت داشت. از این پروتئین می توان در آینده برای تولید آنتی بادی جهت آزمون های سرولوژی استفاده نمود. واژه های کلیدی: بیان پروتئین پوششی، ویروس پیچیدگی برگ شلغم، سیستم پروکاریوتی

چکیده ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندرقند (bctiv) جدید ترین عضو جنس کرتوویروس است که اخیرا از ایران گزارش شده است. به منظور ردیابی و شناسایی این ویروس در طبیعت، از روش های سرولوژیکی مبتنی برواکنش آنتی بادی-آنتی ژن و روش های مولکولی استفاده می شود. تحقیق حاضر با هدف تسهیل فرآیند شناسایی سرولوژیکی ویروس با استفاده از تولید آنتی بادی نوترکیب، پایه ریزی شد. بدین منظور، در ابتدا ژن پروتئین پوششی ویروس در ناقل بیان پروکاریوتی (pqe60) همسانه سازی گردید. سپس پلاسمید نوترکیب بدست آمده به باکتری e. coliسویه m15، منتقل شد. در مرحله بعد پس از القای بیان، پروتئین مورد نظر استخراج شد و با تکنیک sds-page در ژل پلی اکریل آمید 5/12% مورد بررسی قرار گرفت. پس از رنگ آمیزی ژل، پروتئین بیان شده با اندازه قابل انتظار مشاهده گردید. بر این اساس، وزن مولکولی پروتئین پوششی با استفاده از نرم افزار آنلاین expasy برابر 73/29 کیلو دالتون محاسبه گردید که با وزن مولکولی نوار مشاهده شده در آزمون sds-page نیز مطابقت داشت. از این پروتئین می توان در آینده جهت تولید آنتی بادی در کیت های تشخیص سرولوژیکی ویروس استفاده نمود. کلمات کلیدی: ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندرقند، پروتئین پوششی، بیان، سیستم پروکاریوتی.

چکیده جذب بیولوژیکی فلزات سنگین یک روش موثر برای پالایش فلزات سنگین از محیط های آبی و پساب های صنعتی می باشد. در این تحقیق ابتدا یک جلبک از بین چندین گونه جلبکی با توجه به فراوانی و توانایی مقاومت به غلظت های بالای بُر انتخاب شد و سپس توانایی آن در کاهش میزان بُر مورد مطالعه دقیق تر قرار گرفت. تیمارهای آزمایش شامل دو سطح مختلف بیوماس جلبک (2 و 4 گرم), در 5 زمان متفاوت انکوباسیون ( 2, 12, 24, 48 و 72 ساعت) در مقادیر مختلف بُر تحت غلظت های( 5, 10, 15, 25 و 100 پی پی ام ) بود. آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح آماری کاملا تصادفی با سه تکرار انجام گردید و نتایج نشان داد که در غلظت های 5 و 10پی پی ام بُر و ساعات 12 و 2 بیشترین میزان جذب بُر توسط سلول های جلبک صورت می گیرد. همچنین میزان جذب بُر در سطح 4 گرم جلبک بیشتر بود. مرحله شناسایی مورفولوژیکی از طریق مشاهده میکروسکپی انجام گرفت که با توجه به وجود فیلامنت های غیر منشعب و منفرد و باندهای مارپیچی کلروپلاست به عنوان دو مشخصه اختصاصی, جلبک انتخاب شده اسپیروژیرا تشخیص داده شد و در نهایت استخراج dna و انجام pcr به منظور شناسایی مولکولی انجام شد.

یک جهش به عنوان تغییر یا تعویض ارثی در ماده ژنتیکی تعریف می شود. با توجه به اهمیت شناسایی جهش ها در طول سال های اخیر دانشمندان به راهکارهایی برای شناسایی آن ها پرداختند. تکنیک هضم آنزیمی dna هترودوپلکس یکی از متداول ترین تکنیک های مورد استفاده در شناسایی جهش های نقطه ای در قطعات ژنومی است. در طی سال های اخیر آنزیم های خانواده ی cel مهمترین نوکلئازهای مورد استفاده در این زمینه هستند که به صورت کیت های تجاری عرضه می شوند. در زمینه تولید این نوکلئازها در سیستم باکتریایی فعالیت های زیادی صورت گرفته، ولی هیچ کدام به تولید نوکلئاز فعال منجر نشده است از آنجا که اغلب نوکلئازهای اختصاصی تک رشته در حالت فعال بصورت گلیکوپروتئین خارج سلولی می باشند، لذا می توان مهم ترین دلیل این اتفاق را عدم قابلیت سیستم باکتریایی درگلیکوزیله نمودن پروتئین بیان شده دانست. واحدهای گلیکان متصل به آنزیم cel ii در تعیین فعالیت این آنزیم تأثیر چندانی ندارند درنتیجه انتظار می رود که آنزیم cel ii تولید شده در سیستم باکتریایی فعال باشد.بنابراین در تحقیق حاضر با توجه به اهمیت آنزیم cel ii که آنزیم اصلی در کیت تشخیص جهشsurveyor می باشدو همچنین به دلیل اینکه تولید این آنزیم در سیستم باکتریایی به تولید فرم فعال آن منجر خواهد شد سازه ی بیانی آن ساخته شد.

موفقیت برنامه های اصلاحی با هدف نهایی بهبود عملکرد محصول بخاطر فقدان درک روشن از اساس مولکولی تنش شوری تاکنون چندان چشمگیر نبوده است. اصلاح خاک، زهکشی وکنترل آبیاری اگرچه قادر به تقلیل میزان گسترش خاک های شور است، با این حال هزینه های مهندسی و مدیریتی آن بالا است. یکی دیگر از راه های ایجاد گیاهان متحمل به شوری از طریق روش های مرسوم اصلاح نباتات است . بهبود صفات متحمل به شوری به دلیل اینکه این نوع صفات کمی هستند و توسط تعداد زیادی ژن کنترل می شوند از طریق اصلاح نباتات کلاسیک با مشکلاتی همراه بوده است که بخشی از این مشکلات با بکارگیری روش های نوین بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک مرتفع می شود. در زمینه بیوتکنولوژی شناخت ژن های دخیل در تحمل به شوری از منابع مناسب یکی از رویکردهای ابتدایی در زمینه گیاهان متحمل به شوری است. در این میان گیاهان سازگار با زمین های شور یا به اصطلاح هالوفیت ها بهترین منبع برای ژن های متحمل به شوری هستند. هالوفیت ها گیاهانی هستند که در محیط های دارای 200 میلی مول نمک یا بیشتر می توانند زنده بمانند و قابلیت تکثیر خود را حفظ کنند. این گیاهان حدود 1 درصد از فلور جهان را تشکیل می دهند. لذا در راستای این امر معرفی و آنالیز ژن های دخیل در فرایند تحمل گیاهان هالوفیت که مهمترین آنها ژن های کدکننده ی آنتی پورتر ها و ترانسپورتر ها، ژن هایی دخیل در بیوسنتز ترکیبات اسمولیت و ژن های کدکننده آنزیم های از بین برنده رادیکال های آزاد می باشند،گام موثری در استفاده از این ژن ها در تولید سازه های ژنی مناسب برای استفاده در فرایند تولید گیاهان تراریخته متحمل می باشد

جنس آلوئه شامل گیاهانی تک پایه و متعلق به خانواده asphodelaceae است که بومی آفریقای شمالی بوده و به واسطه توانایی بالای تحمل شرایط محیطی سخت از لحاظ خشکی و گرمی هوا، در بسیاری از مناطق جهان گسترش یافته است. این جنس دارای بیش از 400 گونه در دنیا می باشد. اکثر تحقیقات انجام شده برروی جنس aloe و به ویژه گونه a. barbadensis محدود به بررسی اثرات و خواص دارویی آن می شوند. گیاهان آلوئه در مناطق وسیعی از ایران که دارای اقلیم مناسب برای رشد خودروی گونه های این جنس می باشند، پراکنده شده اند. با این حال، نقشه پراکنش و تنوع گونه های این جنس در کشور تاکنون تعیین نشده است. در این پژوهش به منظور بررسی تنوع گونه های جنس آلوئه در ایران، 95 بوته آلوئه از مناطق مختلف کشور شامل استان های هرمزگان، سیستان و بلوچستان، فارس، کرمان، بوشهر، جزیره قشم و گلخانه های زینتی سراسر کشور جمع آوری شد. نمونه های مورد نظر در ابتدا بر اساس شاخص های مورفولوژیکی به گروه های مختلف تفکیک شدند. برای هر گروه مورفولوژیکی، بخشی از ژن rbcl کلروپلاستی در واکنش های pcr با آغازگرهای اختصاصی تکثیر و تعیین توالی گردید. شناسایی گونه-ها از طریق تطبیق توالی قطعه تکثیر شده با توالی متناظر مربوط به هر گروه در بانک جهانی ژن (ncbi) میسر گردید. گونه های aloe barbadensis، a. littoralis و a. greatheadii از رویشگاه های طبیعی جنوب کشور و گونه های a. arborescens، a. spinosissima، a. juvenna و a. delaetti از گلخانه های زینتی جمع آوری شدند. کلمات کلیدی: آلوئه، فلور گیاهی، رده بندی، ژن rbcl، بارکدگزاری

یک سلول یوکاریوتی حاوی هزاران نوع پروتئین مختلف است. هر کدام از این پروتئین ها برای انجام وظایف خود باید به مکان عمل مناسب هدف دهی شود. پروتئین ها معمولا در سیتوپلاسم ساخته می شوند و سپس بر حسب نوع سیگنال پپتید به اندامکهای مختلف فرستاده می شوند. امروزه تراریخته سازی و تولید پروتئین های هترولوگ، یکی از موضوعات مهم در مهندسی ژنتیک گیاهی است. ژن گزارشگر، یک ژن محک است که بیان آن منجر به فنوتیپ قابل سنجش می شود. از سیستم گزارشگر، برای بررسی و تحلیل بیان ژن در گیاه و همچنین بهینه سازی پارامترهای انتقال موفقیت آمیز ژن، استفاده می شود. ژن های گزارشگر زیادی برای ارزیابی محصولات تراریخته وجود دارند که یکی از پرکاربردترین گزارشگرهای سیستم گیاهی، gfp یا پروتئین فلورسنت سبز است. gfp یک پروتئین کوچک 27 کیلو دالتونی با 238 اسیدآمینه است که هنگامی که به وسیله نور فرابنفش یا آبی برانگیخته می شود، نور سبز قابل رویت از خود ساطع می کند. این پروتئین برای تولید نور سبز به هیچ کوفاکتور یا سوبسترایی نیاز ندارد. یکی از نسخه های اصلاح شده gfp، پروتئین mgfp5-er است که سیگنال پپتید موجود در ناحیه n-terminal موجب هدایت آن به شبکه اندوپلاسمی می شود. در این تحقیق توالی کد کننده mgfp5-er با استفاده از چهار سری آغازگر اختصاصی از روی ژن mgfp5 موجود در پلاسمید pcambia 1304 مونتاژ شد و برای حفظ آن، ژن مورد نظر در ناقل ptz57r/t کلون گردید. خصوصیت منحصر به فرد این ژن نسبت به دیگر گزارشگرها، سیگنال ترشحی اضافه شده به آن است. می توان با اتصال ژن مورد نظر به این گزارشگر و بیان آن تحت یک پروموتور مناسب، هم بیان و هم مسیر انتقال آن را در گیاه مورد کنترل قرار داد و همچنین می توان آن را مستقیما در فضای بین سلولی تولید کرد.

ویروس x سیب زمینی از خانواده flexiviridae و جنس potexvirus می باشد یکی از رایج ترین و گسترده ترین ویروس های آلوده کننده سیب زمینی در جهان می باشد. برای ردیابی و شناسایی این ویروس در طبیعت، از روش های سرولوژیکی مبتنی بر واکنش بین آنتی بادی و آنتی ژن و روش های مولکولی استفاده می شود. به دلیل گسترش این ویروس در ایران و با توجه به خسارت اقتصادی آن در نقاط مختلف، شناسایی و ردیابی این ویروس با استفاده از روش های با صرفه تر ضروری می باشد. تولید آنتی بادی چندهمسانه ای شده از طریق روش های مولکولی، با استفاده از تولید آنتی بادی نوترکیب و با هدف تسهیل فرآیند شناسایی سرولوژیکی ویروس، می تواند در شناسایی این ویروس مفید باشد. بدین منظور، در ابتدا ژن پروتئین پوششی ویروس در ناقل بیان پروکاریوتی (pqe60) همسانه سازی گردید. سپس باکتری نوترکیب بدست آمده به باکتری escherichia coli سویه m15، منتقل شد. پس از القای بیان، پروتئین موردنظر استخراج گردید و با تکنیک sds-page در ژل پلی آکریلامید 5/12% مورد بررسی قرار گرفت. پس از رنگ آمیزی ژل، مشخص گردید که وزن مولکولی نوار مشاهده شده در آزمون sds-page با وزن مولکولی پروتئین پوششی بدست آمده با استفاده از نرم افزار آنلاین expasy نیز مطابقت دارد. به منظور تأیید بیان پروتئین پوششی ویروس از تکنیک دات بلات استفاده گردید که تأیید کننده بیان پروتئین پوششی pvx می باشد.

قارچ rhizoctonia solani ag-1 به عنوان یکی از مهمترین قارچ¬های بیمارگر گیاه برنج است. اهمیت این قارچ در کشاورزی با توجه به ایجاد بیماری مخرب شیت¬بلایت در برنج روز به روز بیشترمی¬شود. مبارزه با این بیماری از طریق روش¬های کنترل بیولوژیکی مورد توجه متخصصین قرار گرفته است. اکتینومیست¬ها باکتری¬هایی گرم مثبت و رشته¬ای هستند که بخش اعـــظم میکروارگانیسم¬های خاک را در بر می¬گیرند و با خصلت پراکنش گسترده، رشد ریسه¬ای در خاک، توانایی در کلونیزه کردن سطح ریشه گیاه، اثرات بازدارندگی روی میکروارگانیسم¬ها و تولید متابولیت¬های ثانویه متنوع از جمله آنتی¬بیوتیک¬ها، به عنوان عوامل قوی در کنترل بیولوژیک علیه بسیاری از عوامل قارچی بیماریزای گیاهی به شمار می¬روند. در این تحقیق جهت کنترل بیولوژیک قارچ عامل شیت¬بلایت برنج، فعالیت آنتاگونیستی25 جدایه اکتینومیستی از مزارع برنج استان گیلان مورد بررسی قرار گرفت. غربالگری از طریق آزمون زیستی به روش دیسک-آگار صورت پذیرفت و سه جدایه استرپتومایسس g، 5 و uبیشترین اثر بازدارندگی از رشد بیمارگر مورد بررسی را داشتند. در ارزیابی¬های گلخانه¬ای ثابت گردید که جدایه¬های مذکور موجب کاهش قابل توجه شدت علائم بیماری می¬شوند. جهت تعیین هویت این جدایه¬ها، در سطح جنس، آنها مورد ارزیابی¬های مورفولوژیکی، خصوصیات شیمیایی و بررسی¬های مولکولی با استفاده از توالی ژن rrna s16 قرار گرفتند و هویت آنها به عنوان سه گونه متعلق به جنس استرپتومایسس مورد تایید قرار گرفت.

پالایش زیستی به معنای استفاده از موجودات زنده از جمله قارچ ها, باکتری ها و گیاهان برای از بین بردن آلاینده های زیست محیطی و کاهش اثرات سمی آنها بر سلامت انسان و محیط زیست است. این فناوری در سال های اخیر از اهمیت و توجه بسیار زیادی برخوردار شده است. مشکل آلودگی منابع آب و خاک ناشی از ترکیبات ارگانوفسفره در بسیاری از کشورهای دنیا مطرح است. در این مطالعه از خاکهای کشاورزی آلوده به این ترکیبات (به خصوص سموم کلروپایریفوس و دیازینون) در استان کرمان نمونه برداری صورت گرفت. نمونه های خاک با استفاده از محیط کشت نمکی معدنی غنی شده با سموم تجاری کلروپایریفوس و دیازینون با روشهای استاندارد آزمایشگاهی مورد غربال گری قرار گرفتند و سویه های باکتریایی با توانایی هیدرولیز و حذف بیولوژیکی ترکیبات ارگانوفسفره جداسازی شدند. برای اطمینان از قابلیت تجزیه سموم ارگانوفسفره توسط سویه های جداسازی شده, توانایی آن ها برای تجزیه و مصرف ماده موثره خالص متیل پاراتیون مورد بررسی قرار گرفت . نتایج نشان داد که این جدایه ها دارای آنزیم های تجزیه کننده سموم ارگانوفسفره بوده و می توانند از این ترکیبات به عنوان منبع کربن و فسفر استفاده نمایند. شناسایی جدایه های باکتری غربال شده با استفاده از روشهای بیوشیمیایی و آزمون های فعالیت آنزیمی و همچنین تعیین توالی ژن کد کننده 16s rrna انجام شد. ده جدایه باکتری از گونه های pseudomonas putida, pseudomonas aeruginosa, stenotrophomonas maltophilia, acinetobacter radioresistens و ochrobactrum sp. به عنوان میکروارگانیسم هایی با قابلیت تجزیه زیستی ترکیبات ارگانوفسفره معرفی گردیدند.

استفاده از موجودات بیولوژیک مانند میکروارگانیسم ها و عصاره های گیاهی برای تولید نانو ذرات می تواند جایگزین مناسبی برای تولید فیزیکی و شیمیایی آن ها باشد که برای محیط زیست نیز صدمه ای وارد نمی کند. در مطالعه حاضر ، روش زیست سازگار بیوسنتز نانو ذرات نقره توسط عصاره بذری پنبه دانه و بارهنگ مورداستفاده قرار گرفت و خاصیت ضد باکتریایی آن بر روی چند گونه باکتری گرم مثبت، گرم منفی و فعالیت ضد قارچی روی قارچ رایزوکتونیا سولانی و خاصیت ضد سرطانی آن بر روی سلول های سرطانی پستان رده mcf-7 بررسی گردید. مشخصات نانو ذرات تولیدشده توسط عصاره بذری پنبه دانه و بارهنگ به وسیله آنالیزهای اسپکتروسکوپی جذب uv-visible، xrd و tem بررسی گردید.تأثیر عصاره بذری پنبه دانه و بارهنگ قبل و بعد از بیوسنتز نانو ذرات با روش mtt بر سلول رده mcf-7 بررسی شد. xrd بیوسنتز نانو ذرات نقره را در پیک های 111 ، 200، 220 و 311 ساختار کریستالی نانوذره نقره را تائید کرد. عکس tem شکل کروی نانو ذرات با اندازه تقریبی20-1 نانومتر را با توزیع نرمال نشان داد. این عصاره ها همراه با نانو ذرات نقره کاهش معنی داری در کنترل رشد سلول های سرطانی داشت. بنابراین ، عصاره های مذکور و نانو ذرات نقره تولیدشده به وسیله آن ها اثرات مفیدی در مهار رشد باکتری و قارچ و درمان سرطان پستان دارند.

در کنار روش های شیمیایی از قارچ ها، باکتری ها، مخمرها، جلبک ها و به ویژه گیاهان به منظورسنتز نانو ذرات از ترکیبات معدنی استفاده شده است .در این پژوهش نانو ذرات نقره با استفاده از عصاره گیاهان چای کوهی و خلر سنتز شدند. اثرات زمان های مختلف بر سنتز نانو ذرات بررسی شد. نتایج اولیه حاکی از تغییر رنگ عصاره ها از قهوای به خرمایی و از سفید به قهوه ای بود که شاخصی اولیه در تولید نانو ذرات نقره است. آنالیز طیف سنجی uv-visible، وجود پیک جذبی در 420 نانومتر را نشان داد که حاکی از بیوسنتز نانو ذرات نقره در عصاره است. نتایج میکروسکوپ الکترونی (tem) اندازه ذرات تولید شده در عصاره را کمتر از 5 نانومتر نشان داد. آنالیز الگوی پراش اشعه ایکس(xrd) الگوی صفحات کریستالی (111)، (200)، (220) و (311) را نشان داد. طیف سنجی ftir، نقش گروه های عاملی فعال که مسئول احیاء یون های نقره در فرآیند بیوستنز بودند را نشان داد و هم چنین آنالیز اسپکتروسکوپی نشر اتمی (icp)، درصد تبدیل یون های نقره به نانو ذره نقره را در گیاهان چای کوهی و خلر به ترتیب 73/99 و 67/ 99 درصد تعیین کرد. بررسی خاصیت ضد قارچی نانو ذرات نقره سنتز شده بر روی دو قارچ dothiorella sarmentorum و spencermatinsia vticola، در قالب طرح کاملا تصادفی و به روش حلقه بازدارندگی انجام شد، و این نتایج نشان داد که اثر بازدارندگی نانو ذرات نقره سنتز شده توسط عصاره گیاهان چای کوهی و خلر بر روی قارچ های مورد بررسی اختلاف معنی داری در سطح یک درصد داشت و عصاره های حاوی این نانوذرات توانست خاصیت ضد قارچی نسبت به عصاره شاهد از خود نشان دهند.

انواع مواد با ارزشی مانند نانو مواد، کود ها، سموم و بسیاری از مواد پلیمری طی فرآیندهای شیمیایی با مصرف انرژی و ترکیبات سمی تولید می شوندکه در مواردی نه تنها سلامت انسان و محیط زیست را تهدید می نمایند بلکه سرطان زا نیز می باشند. ترکیبات سمی مورد استفاده پس از ورود به محیط زیست، وارد زنجیره غذایی شده و نهایتاً اثرات مخرب زیست محیطی در کلیه سطوح هرم اکولوژیک، برای محیط زیست متجلی می سازند. امروزه مقرون به صرفه بودن روش کافی نمی باشد، بلکه زیست سازگار بودن و بی خطر بودن روش از جنبه های مهم استفاده از آن می باشد. هدف از شیمی سبز عدم استفاده یا کاهش مصرف انرژی و ترکیبات مضر برای محیط زیست و جلوگیری از آلودگی در منشأء آن می باشد. در سنتز بیولوژیکی نانوذرات، ترکیبات طبیعی و عوامل بیولوژیک موجود در عصاره های گیاهی مانند آنزیم ها، کربوهیدرات ها و ترپنوئید ها جایگزین ترکیبات و حلال های شیمیایی مضری می شوند که در روش های شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرند؛ بنابراین سنتز نانوذرات با استفاده از منابع طبیعی منجر به کاهش مراحل سنتز و کاهش استفاده از انرژی و حلال شیمیایی تخریب کننده محیط زیست می شوند؛ بنابراین در این پژوهش، در راستای اهداف شیمی سبز، سنتز سبز نانوذرات طلا و نقره با استفاده از گیاهان به عنوان منبع زیستی سنتز بدون استفاده از عوامل شیمیایی احیاء کننده و پایدار کننده انجام گرفت. تاثیر زمان، ph، غلظت های نیترات نقره، دما، عصاره اندام های مختلف یک گیاه، نوع گونه گیاه در سنتز نانوذرات مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی سنتز و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانوذرات طلا و نقره با استفاده از uv-visible اسپکتروفتومتری، پراش اشعه ایکس(x-ray) ، میکروسکوپ الکترونی عبوری(tem) ، طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه ((ftir، طیف سنجی نوری بر اساس نشر نور و برانگیختگی به کمک پلاسما ((icp و پراکنش دینامیکی نور ((dls مورد مطالعه قرار گرفتند. در مرحله دوم برخی کاربرد های نانوذرات در شاخه های متفاوت از علوم زیستی بررسی شد. اثر ضد میکروبی، ضد سرطانی، ضد قارچی، نماتود کشی نانوذرات نقره بررسی شد. پس از بررسی فعالیت های زیستی، کاربرد نانوذرات نقره در ساخت محیط کشت بافت های گیاهی ضد میکروبی حاوی نانوذرات و همچنین ساخت پوشش ها و الیاف ضد میکروبی بررسی گردید.

ژن گزارشگر gfp به منظوربهینه سازی سیستم انتقال ژن در مهندسی ژنتیک کاربرد فراوان دارد. ویژگی های منحصر به فرد این پروتئین باعث شده است تا gfp بیش از هر گزارشگر دیگری در مطالعات ملکولی استفاده شود. gfp هنگامی که بوسیله نور فرابنفش یا آبی برانگیخته شود، نور سبز قابل رویت از خود ساطع می کند.این پروتئینپایدار است و تابش رنگی آن از طریق یک سیکل خودکاتالیزوری درونی ایجاد میگردد که نیازمند هیچ کوفاکتور یا سوبسترایی نیست.یکی از نسخه های اصلاح شده gfpکه به طور صحیح در گیاهان بیان شده، پروتئین mgfp5-er است. توالی سیگنال ترشحی ناحیه n-terminal، سبب ورود آن به مسیر ترشحی سلول می شود.ترشحی بودن یک پروتئین امکان بازیافت آن از آب میان بافتی مواد گیاهی تراریختهرا به سادگی و با کمترین هزینه فراهم میکند.در این پژوهش توالی کدکننده پروتئینmgfp5-er در ناقل بیان گیاهی pbi121 تحت کنترل پیش برنده camv35s و خاتمه دهنده nos همسانه سازی شد. پلاسمید ناقل دوگانه نوترکیب pbi-mgfp5-er با استفاده از تکنیک های pcr و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت. سازه ی تهیه شده pbi-mgfp5-er با استفاده از روش ذوب و انجماد به آگروباکتریوم تومفاشینس سویه های lba4404 و gv3850 انتقال داده شد و با استفاده از روش دیسک برگی در ژنوم گیاه توتون ادغام شد. انتخاب اولیه سلولهای تراریخته گیاه توتون برروی محیط حاوی کانامایسین صورت پذیرفت .واکنش زنجیره ای پلیمراز بااستفاده ازآغازگرهای اختصاصی بر روی dnaژنومی سلول های گیاهی تراریخته وهمچنین مشاهده سیگنال فلورسانس mgfp5-er تحت تابش نور uv365nm، انتقال ژن mgfp5-er به گیاه توتون را اثبات نمود.

در این تحقیق اثر فلزات سنگین روی رشد گیاه littoralis aeluropus و الگوی بیان ژن‏های رمز کننده na+/h+ آنتی پورتر غشای پلاسمایی و واکوئلی در این گیاه مورد بررسی قرار گرفت. به همین منظور گیاهچه‏ها به صورت جداگانه تحت تنش فلزات سنگین سرب ، نقره و جیوه و شوری قرار گرفتند. صفات وزن ریشه، وزن ساقه، وزن کل، طول ریشه، طول ساقه، طول کل گیاه و میزان تجمع فلزات ذکر شده در گیاه اندازه‏گیری شد و تغییرات بیان دو ژن رمز کننده na+/h+ آنتی پورتر غشای پلاسمایی و واکوئلی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که فلزات سنگین به طور معنی‏داری تمام صفات مورفولوژیک بجز طول ساقه را تحت تاثیر قرار دادند. نتایج بررسی الگوی بیان ژن نشان داد که از میان فلزات، نقره بیشترین اثر را روی بیان هر دو ژن رمز کننده na+/h+ آنتی پورتر غشای پلاسمایی و واکوئلی داشته است. همچنین مشخص شد که بیان این دو ژن 6 ساعت پس از اعمال تنش به حداکثر میزان خود می‏رسد و سپس کم می‏شود. در نهایت بر اساس نتایج این تحقیق می‏توان عنوان کرد که گیاه littoralis .a می‏تواند به عنوان یک گیاه انباشتگر فلزات سنگین در نظر گرفته شود.