بیان نوترکیب و تخلیص زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپa در e. coli از یک ژن مصنوعی
چکیده
نوروتوکسین های بوتولینوم، سمی ترین ترکیبات بیولوژیک شناخته شده اند که باعث ایجاد فلج عضلانی میشوند. خاصیت آنزیمی این توکسین ها، مهار آزادسازی میانجی عصبی استیل کولین را باعث میشود. مطالعه حاضر با هدف تولید نوترکیب بخش کاتالیتیک (زنجیره سبک) سم بوتولینوم تیپ a با درصد خلوص بالا، به منظور ارزیابی فعالیت آنزیمی انجام شد. توالی ژن زنجیره کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ a از پایگاه ژنی ncbi گرفته شد. پس از بهینه سازی کدون ترجیحی ژن مورد نظر برای e.coli، توالی نهایی ژن به منظور سنتز در وکتور بیانی pet28a(+) سفارش داده شد. پس از انتقال وکتور بیانی نوترکیب دارای ژن مذکور به میزبان e.coli bl21-de3 ، فرایند بیان در شرایط استاندارد انجام شد. در ادامه تولید پروتئین مورد نظر به شکل محلول با بهینه سازی کشت میزبان و بیان پروتئین صورت پذیرفت. پروتئین بیانی به وسیله ستون ni-nta تخلیصو با آنتی بادی اختصاصی مورد تأیید قرار گرفت. در این تحقیق بالاترین میزان بیان به شکل محلول، در شرایط غلظت 5/0 میلی مولار iptg، با جذب نوری 5/0 و زمان القای 18 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد به دست آمد. آزمایش های وسترن بلات و الایزا، وجود پروتئین هدف را تأیید کردند.براساس نتایج، زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ a به شکل محلول تولید شد. فرایند تخلیص نیز با رزین تمایلی با کیفیت عالی انجام شد به طوری که پروتئین مورد نظر با درصد خلوص 98 به دست آمد.