همسانه سازی و بیان ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ e در باکتری e.coli
چکیده
سابقه و هدف: باکتری های کلستریدیوم بوتولینوم هفت نوع نوروتوکسین تولید می کنند که تیپ های a، b، e و f منجر به بوتولیسم در انسان می شوند. یکی از روش های درمانی بوتولیسم می تواند از طریق مهار فعالیت آنزیمی ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم توسط مهارکننده ها باشد. در این مطالعه، ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ e در وکتور بیانی pet28a همسانه سازی و در باکتری میزبان e. coli سویه bl21(de3) بیان شده است. مواد و روش ها: به منظور همانندسازی ناحیه مورد نظر، dna ژنومی باکتری استخراج گردید. با استفاده از واکنش pcr توالی مورد نظر تکثیر شد. سپس محصول pcr در وکتور pgem-t easy وارد و وکتور نوترکیب به سلول های میـزبان e. coli سویه dh5α منتقل گردید. سپس با واکنش الحاق محصول همسانه سازی شده از وکتور pgem-t easy به وکتور بیانی pet28a منتقـل شد. در نهایت پلاسمیـد نوترکیب pet28a به باکتـری e. coli سویه bl21(de3) انتقال داده شد. بیان ناحیه کاتالیتیک در شرایط استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت. یافته ها: نتایج حاصل از برش آنزیمی و واکنش pcr بیانگر همانندسازی و زیر همانندسازی به ترتیب در وکتورهای pgem-t easy و pet28a بود. نتایج تعیین توالی نیز صحت حضور توالی مورد نظر را تأیید کرد. در نهایت بیان قطعه مورد مطالعه، با استفاده از ژل sds-page و آزمایش وسترن بلات تأیید گردید. استنتاج: همسانه سازی توالی مورد مطالعه، به ترتیب در وکتورهای pgem-t easy و pet28a با صحت کامل انجام گرفت. همچنین نتایج بیان و تأیید محصول بیانی در باکتری e. coli bl21(de3) بیانگر صحت بیان محصول مورد نظر بود.