همسانه سازی ژن پیروات دکربوکسیلاز مؤثر در تولید بیواتانول در باکتری اشرشیا کلای
چکیده
مقدمه: اتانول ساخته شده از زیست توده یکی از راهبردهای بی نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می تواند به عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت های فسیلی شود. مواد و روشها: در این پژوهش کلیدی ترین آنزیم مؤثر در مسیر تولید اتانول زیستی (پیروات دکربوکسیلاز) از زایموموناس موبیلیس انتخاب و در اشرشیا کلای به روش ذوب-انجماد همسانه سازی شد. برای همسانه سازی ژن مدنظر از آغازگرهای اختصاصی ژن پیروات دکربوکسیلاز و واکنش پی سی آر استفاده شد. سپس ژن پیروات دکربوکسیلاز و پلاسمید pet 28a را آنزیم های محدودکننده sal i و xho i برش دادند؛ محصولاتی که آنزیم لیگاز برش دادند در دمای ۱۶ درجه سانتی گراد و در مدت ۱۶ ساعت به همدیگر متصل شدند. نتایج: کشت باکتری ها در محیط کشت lb انتخابی نشان داد که تنها کلونی های حاوی پلاسمید pet 28a قادر به رشد هستند. نتایج کلونی پی سی آر با آغازگرهای اختصاصی باندهایی در اندازه تقریبی ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد. نتایج مربوط به پی سی آر پلاسمیدهای نوترکیب توسط آغازگر رفت راه انداز t7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز، جهت صحیح درج ژن در داخل پلاسمید را ثابت کرد و باندی به اندازه ۱۸۸۵ جفت باز را نشان داد و نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدpet 28a pdc نوترکیب توسط آنزیم های sal i و xho i باندهای مشابهی را آشکار کرد. درنهایت واکنش rt باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد که حاکی از بیان ژن مورد نظر در این نمونه ها بود. بحث و نتیجهگیری: از مهم ترین مشکلات در بیوسنتز اتانول، محدودیت عملکرد آنزیم های درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول از مواد اولیه نظیر ضایعات کشاورزی است؛ این آنزیم ها در تبدیل مواد اولیه پلی مری به مواد اولیه با ساختار ساده و قابل تخمیر نقش اساسی دارند. به نظر می رسد افزایش بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز تحت کنترل پروموتور قوی t7 منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد شد.