ساخت وکتور minicircle حامل ژن مقاومت به پورومایسین

پلاسمیدها انواعی از ناقلهای غیر ویروسی هستند که برای انتقال ژن بکار می روند. پلاسمید های معمول که در ژن درمانی استفاده می شوند، از دو قسمت تشکیل شده اند که عبارتند از توالی های باکتریایی و واحد نسخه برداری که حاوی ژن مورد نظر و توالی های لازم برای بیان آن در سلول های یوکاریوتی می باشد. توالی های باکتریایی از جمله مبدا همانندسازی باکتریایی و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک برای تکثیر و غربالگری در باکتری لازمند اما این توالی ها می توانند سبب ایجاد مشکلات جدی در زمینه ایمنی زیستی شوند. وجود توالی های باکتریایی در پلاسمید ها علاوه بر ایجاد مشکلات ایمنی، بیان ژن را نیز کاهش می دهند، دلیل اصلی این کاهش بیان ، این است که با گذشت زمان توالی های باکتریایی توسط پروتئین های خاموش کننده در سلول های یوکاریوتی شناسایی می شوند و در اثر قرار گرفتن این پروتئین ها هتروکروماتینی می شوند . با گذشت زمان به علت وجود اتصالات کووالانسی بین توالی های باکتریایی و توالی های یوکاریوتی، ژن مورد نظر نیز هتروکروماتینی شده و خاموش می شود. بر همین اساس وکتورهای minicircle ساخته شدند. وکتور های minicircle پلاسمید هایی هستند که توالی های باکتریایی آن ها، به واسطه ی یک نوترکیبی داخل مولکولی حذف شده است. در این مطالعه ابتدا یک حامل minicircle حاوی ژن مقاومت به پورومایسین (puro) ساخته شد. به این منظور ابتدا یک پلاسمید والدی ساخته شد که حاوی ژن اینتگراز ?c31 قابل کنترل با پروموتر قابل القای arabad ، توالی های attp وattb اختصاصی ژن اینتگراز?c31 در دو طرف ژن puro و توالی های لازم برای بیان آن ، یک شاخص انتخابی برای غربالگری در باکتری ها و توالی شروع برای همانند سازی در باکتری می باشد. با القای بیان اینتگرازتوسط آرابینوز، فرآیند نوترکیبی توسط اینتگراز صورت گرفت و minicircle حاوی ژن puro در باکتری e. coli ساخته شد. هدف از ساخت این وکتور استفاده از آن در غربالگری رده های سلولی پایدار بود. در این مطالعه، وکتور minicircle حاوی ژن egfp نیز ساخته شد. برای ساخت وکتور minicircle حاوی ژن egfp، ژن egfp به همراه پروموتر cmv جایگزین ژن puro و توالی پروموتری در پلاسمید والدی گردید. یکی از خصوصیات این وکتور این است که پس از ژن egfp چندین جایگاه برش برای آنزیم های محدود کننده دارد، بنابراین از این وکتور می توان برای ساخت وکتور های minicircle حاوی ژن های مختلف دارای قابلیت ردیابی با استفاده از خاصیت فلورسنت پروتئین egfpاستفاده کرد. مطالعات قبلی نشان داده اند که وکتور های minicircle نسبت به پلاسمید های معمول مزایایی دارند از جمله:1- وکتور های minicircle به علت حذف توالی های باکتریایی، بیان بالایی دارند. 2- وکتور minicircle به صورت خارج کروموزومی باقی مانده و در ژنوم الحاق نمی شود. 3- اندازه کوچک این وکتور ها نسبت به پلاسمید های معمول، ورود آن ها را به هسته تسهیل می کند.